内生真菌长期以来以寄生或共生等方式与宿主植物共存,特别是内生于某些药用植物中的真菌,在与宿主植物协同进化的过程中,参与到药用植物的新陈代谢或某类活性化合物的合成过程,而能产生相同或相似的化合物,是获得新天然产物的重要来源。从甘草中筛选产甘草酸等有效成分的内生真菌然后利用发酵培养来生产甘草有效成分有可能是一种全新选择。首先,以选择合适培养条件、优化表面灭菌条件、选择最佳甘草材料三方面入手,为更好地分离甘草根中的内生真菌提供依据并奠定基础。其次,研究不同产地甘草内生真菌多样性,构建甘草的专属内生真菌菌种库。从不同产地收集甘草样品,分离纯化后获得大量内生真菌,并经形态和ITS序列鉴定种类,研究不同产区甘草的内生真菌多样性。再次,采用HPLC初筛、UPLC-MS复检的方法检测已得到的甘草内生真菌发酵产物中的成分,准确筛选产生甘草有效成分菌株,目标成分主要有甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素等。最后,选取甘草干燥过程中不同的时间点,检测甘草根中内生真菌种类和数量,研究其变化规律。本研究的主要结果如下:(1)甘草内生真菌培养可用PDA、PDB培养基,并加入青链霉素混合液来避免细菌污染,添加浓度在50μg/m-100μg/mL之间,可消除细菌且不影响真菌生长。最佳表面灭菌条件为:在75%乙醇中浸泡2min,无菌水冲洗1min;5%次氯酸钠溶液浸泡5min,再用无菌水冲洗1min;用75%乙醇漂洗30 S,无菌水冲洗1min,最后,用无菌滤纸吸干表面水分。要想获得尽量多的内生真菌,应当选择三年生的栽培甘草试验材料。(2)从甘肃、宁夏、内蒙、新疆、北京5个地区的129株甘草样品中共取得706个组织块,分离得到438株内生真菌;经形态鉴定、显微观察及真菌得ITS鉴定,归为5目8属26种,分别有:曲霉属Aspergillus、青霉属Penicillium、镰孢霉属 Fusrium、链格孢属 Altermaria、新赤壳属 Neocosmospora、Uncultured Glomerales、Naganishiaalbida 及 Uncultured fungus 未知菌等;其中鉴定到种的有10种,其中8种为首次在甘草中分离并确认到种;Bionectriaceae、Neocosmospora、Glomerales、Naganishia albida首次在中国地区的甘草中被分离出来。镰孢属、曲霉属、青霉属为甘草中的优势菌。不同产地甘草内生真菌的分离率存在差异:宁夏(85.5%)>甘肃(63.2%)>新疆(62.8%)>内蒙(55.5%)>北京(37.4%),道地产区大于非道地产区。不同产区甘草的内生真菌的类群、分布有所不同:其中镰孢属、曲霉属、青霉属、链格孢属为优势属。甘肃、新疆、内蒙甘草内生真菌中以镰孢属和曲霉属为优势类群;宁夏甘草以镰孢属为优势菌;北京地区甘草的内生真菌优势菌为镰孢属真菌。镰孢属真菌为不同产区共同的优势菌。不同产地甘草内生真菌的多样性也各不相同:多样性指数甘肃(4.81)>新疆(2.40)>宁夏(2.19)>内蒙(2.10)>北京(1.70),道地产区大于非道地产区。(3)获得的甘草内生真菌发酵后,经HPLC初筛UPLC-MS复检得到一株产甘草酸的内生真菌LB-1,LB-1为镰孢属真菌。(4)甘草根干燥过程中,甘草中的内生真菌种类和数量先较快增长,之后趋于稳定,略有增加。