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γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由微生物合成的胞外氨基酸聚合物，具有水溶性好、可生物降解和良好的生物相容性等优点，在环境、医药、食品和化妆品等领域具有广泛的应用前景，是不可降解的合成高分子材料(如塑料和水凝胶等)优良的替代品，因此，开发该产品有利于加快我国高分子产业和产品结构向绿色化和功能化的方向发展。
目前微生物发酵法是γ-PGA合成研究最多的方法，但普遍存在生产成本过高，提取纯化困难等问题。本论文以一株γ-PGA产生菌Bacillus subtilis NX-2为出发菌株，以γ-PGA的高产率、高生产强度和高底物转化率的统一为目标，进行了发酵工艺的优化，分析了γ-PGA合成途径与发酵动力学，提出了合适的底物流加策略，同时建立了一条适于工业化生产并获得高纯度颗粒成形的γ-PGA提取纯化工艺。此外，本文还进行了γ-PGA降解酶的表达与性质和γ-PGA酶解的研究。主要研究结果如下：
1.采用较为简单的发酵培养基，以葡萄糖和L-谷氨酸为碳源，其余为无机盐，降低了原料成本，并避免了发酵液成分过于复杂利于γ-PGA的分离纯化，优化了B.subtilis NX-2的摇瓶培养基条件，确定了影响γ-PGA合成的重要因素为L-谷氨酸和葡萄糖，其次为(NH4)2SO4。优化的培养基成分为：即葡萄糖53.97 g L-1，L-谷氨酸55.34 g L-1，(NH4)2SO49.08 g L-1，MnSO4·H2O0.03 gL-1，MgSO40.1 g L-1，K2HPO420 g L-1。在优化条件下，平均γ-PGA产率达26g L-1。
2.7.5 L发酵罐中B.subtilis NX-2分批发酵合成γ-PGA的最佳培养条件为：通气量1.2 L(L-1min-1)，搅拌转速400 r/min，控pH7.0。在优化培养条件下，γ-PGA的产率达到24 g L-1。根据B.subtilis NX-2分批发酵合成γ-PGA的实验数据，建立了能较为精确地描述发酵过程中菌体生长、产物合成和底物消耗的动力学模型：
(1)菌体生长的动力学模型：
dX/dt=0.111(1-X/4.226)X
(2)γ-PGA合成的动力学模型：
dP/dt=0.274 dX/dt+0.005XSp-0.011P
(3)葡萄糖消耗的动力学模型：-dSx/dt=3.268 dX/dt+0.114X
(4)L-谷氨酸消耗的动力学模型：-dSp/dt=1.183 dP/dt-0.011P
3.采用13C标记葡萄糖，探究了构成γ-PGA碳骨架的单体来源，推测了γ-PGA可能的合成途径。实验结果表明，培养基中葡萄糖浓度为40 g L-1时，γ-PGA碳骨架中由葡萄糖进入的比例约为9％左右，葡萄糖浓度为30 g L-1时，由葡萄糖进入γ-PGA的比例降至约6％，即由葡萄糖转化进入γ-PGA分子的碳骨架仅占小部分，而L-谷氨酸为γ-PGA碳骨架的主要来源。葡萄糖主要作为生长限制性底物用于菌体生长和能量代谢。
4.针对分批发酵过程迟滞期过长、γ-PGA高产率、高生产强度和高L-谷氨酸转化率水平难于统一的瓶颈问题，提出了低浓度谷氨酸条件下菌体生长、过程流加L-谷氨酸和葡萄糖的补料策略：降低培养基L-谷氨酸的初始浓度，待γ-PGA比合成速率达到最高时，流加补入L-谷氨酸，克服了分批发酵初期L-谷氨酸浓度过高对菌体生长的抑制作用；同时采用合适的初糖浓度，当糖快耗尽时流加补糖并维持较低的糖浓度，仅供给菌体的代谢维持和合成产物所需的能量，避免了生物量的过量积累。最终γ-PGA的产率达到40.26 g L-1，生产强度达0.42 g L-1h-1，L-谷氨酸转化率高达95％。
5.建立了一条适于工业化生产并最终获得高纯度颗粒成形的γ-PGA提取纯化工艺：酸化发酵液以降低体系粘度，以硅藻土吸附-过滤的预处理方法替代了传统的离心方法，有效实现了菌体分离和杂蛋白的去除，最佳工艺条件为：吸附硅藻土用量为发酵液质量分数的2％，粗细硅藻土的质量配比1.5:1，pH3.0-3.2；采用浓缩-稀释-浓缩的超滤方式，选择截留分子量为100 kDa超滤中空纤维膜，pH3.0条件下γ-PGA的截留率达到96％，过膜通量达到9.7mL/(min·m2)，浓缩效率高，超滤浓缩液的终体积仅为原液体积的22％；采用0.3 mol L-1氯化钠与乙醇体系的醇析-盐析方式精制得到具有颗粒状成形的γ-PGA成品(酸型)，γ-PGA总收率达90％以上，其质量指标已达到化妆品级的要求。
6.研究了γ-PGA发酵过程中γ-PGA降解酶的作用条件，实验结果表明γ-PGA降解酶是一种胞外酶，主要作为稳定期末期营养(碳源)缺乏时菌体生长的应急机制存在。通过PCR方法扩增γ-PGA生产菌株B.subtilis NX-2的内切降解酶ywtD基因，对其序列进行了分析，构建表达载体在大肠杆菌中表达出具有生物活性的聚谷氨酸降解酶。研究结果表明YwtD对γ-PGA具有明显的内切活性，γ-PGA的酶解过程中，γ-PGA分子量可从1，000 kDa降解至20kDa，分子量亦呈窄分布的趋势，因而通过控制酶解反应时间可实现γ-PGA的可控降解得到不同分子量的酶解产物。