聚丁二酸丁二酯[Poly(butylene succinate),PBS]是一种可替代传统塑料的生物可降解塑料,有助于解决白色污染问题,但其在自然界中往往降解缓慢,获取PBS高效降解酶是实现PBS快速降解的关键。本研究通过构建重组毕赤酵母表达体系以实现源于腐皮镰孢中具有PBS降解能力的角质酶(Fusarium solani cutinase,FSC)的高效表达。首先根据毕赤酵母偏好密码子优化FSC的基因密码子,并将基因导入毕赤酵母X33中实现其重组表达。进一步通过单因素实验优化了重组菌株的产酶条件。结果显示,优化后的FSC基因序列中的157个碱基发生改变,G+C含量由59.6%降低到48.3%,序列同源性为77.34%;构建的重组表达载体p PICZα-FSC转入毕赤酵母X33,结合抗性平板初筛、SDS-PAGE和Western bolt验证以及摇瓶发酵酶活力测定获得了一株具有较高产酶能力的重组菌株L1;进一步确定其摇瓶发酵培养条件为:培养基起始p H6.0,摇床转速220r/min,甲醇补加量1%,接种量8%,培养时间72h,培养温度30℃,此优化条件下菌株发酵液的PBS解聚酶活力可达110U/m L。继而采用磁珠法纯化带有His-tag的重组角质酶。重组菌株L1的发酵液经过离心、复溶、透析、与磁珠结合、洗杂以及洗脱再透析等一系列的分离纯化后,得到分子量约为24k D而且纯度较高的重组角质酶。以京尼平为交联剂制备交联磁性壳聚糖微球为载体,在(京尼平浓度为0.6g/L、交联时间为8h、酶浓度为50μg/m L和固定化时间为16h)的条件下将重组角质酶固定到载体上获得固定化角质酶。进一步检测固定化酶的性能:发现固定化角质酶的米氏常数(K_m)有所增大。固定化酶的最适反应温度为50℃,较游离酶提高了5℃;最适反应p H由游离酶的5.0提高到了9.0,说明角质酶经载体固定后具有更好的p H和热稳定性。固定化酶重复操作10次后,酶活性仍可保持50%以上。固定化酶在4℃下储存30d,酶活性仍可保证在88%左右。