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目的旨在克服现有抗原筛选方法的不足,构建我国铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）临床分离株XN-1的全基因组文库,从中筛选PA疫苗的候选抗原,为防控PA感染打下基础。方法1.全基因组文库的构建:提取PA XN-1全基因组DNA,内切酶Sau3A I酶切DNA,内切酶BamH I酶切的载体pMal-c5x。通过连接酶将其与随机基因组片段连接,构建随机重组子质粒。转化随机重组子至大肠杆菌感受态细胞X-Blue中。挑选出随机重组子克隆,通过PCR反应和酶切鉴定等方法,对随机重组子进行初步鉴定,评价插入基因组片段的特点。IPTG诱导溶菌酶上清液的阳性重组子的MBP融合蛋白表达,SDS-PAGE检测其表达情况,从而构建PA XN-1全基因组文库。2.PA候选抗原的筛选及保护效果评价:为了进一步从随机重组子文库中筛选到PA疫苗候选抗原,本研究制备了抗MBP多克隆抗体,将其包被于ELISA板上,以捕获随机重组子表达的MBP融合蛋白。以PA感染患者恢复期血清作为一抗,检测随机重组子携带的未知抗原的反应性。测定强反应性抗原的编码序列,通过BLAST序列比对,获得强反应性抗原的基因信息。通过基因工程手段在大肠杆菌中制备候选抗原免疫Balb/c小鼠。ELISA方法检测抗原特异性IgG抗体效价。气管插管攻毒致死剂量PA XN-1,并统计小鼠生存率。综合评价候选抗原的免疫反应性、免疫原性和免疫保护效果,筛选出新的铜绿假单胞菌疫苗候选抗原。结果1.提取PA XN-1的全基因组,经过Sau3A I酶切处理后,DNA条带弥散分布在100-1000bp之间。这些基因组片段与pMal-c5x载体连接,获得随机重组子克隆若干。随机挑选3个重组子克隆,酶切鉴定发现其中2个有基因组片段的插入;PCR方法检测插入片段大小,发现其插入片段位于100-1000bp之间,具有良好的随机性;IPTG诱导随机重组子表达,SDS-PAGE检测重组子蛋白表达情况,发现随机挑选的6个重组子中,有4个成功表达出MBP融合蛋白。这些结果表明,构建PA全基因组文库成功,可用于下一步强反应性抗原的筛选。2.通过13轮试验,筛选获得随机重组子2392个,得到反应性重组子115个,其中,有13个强反应性抗原（相对于PcrV反应强度大于10%的抗原）。这13个抗原分别为:PpiA、PtsP、OprP、CAZ1034235、HmuU2、PcaK、CarAd、RecG、YjiR5、LigD、KinB、RtcA、PscF。3.通过MBP亲和层析法,成功制备了这13个带有MBP标签的强反应性抗原。动物实验发现以上13个抗原免疫,可分别诱导小鼠产生抗原特异性IgG抗体,其效价与MBP诱导的抗体效价有显著统计学差异（P<0.05）。同时,动物攻毒保护实验发现,候选抗原保护率最高的前五名抗原分别是:PscF、LigD、RecG、OprP和PtsP。其中,抗原PscF的保护率最高达95%,抗原LigD和RecG的保护率达80%,抗原OprP和PtsP的保护率达65%。以上结果提示,抗原PscF的免疫保护效果最优。结论本研究成功建立了我国铜绿假单胞菌临床菌株XN-1的全基因组文库,并从中筛选到13个强反应性抗原。进一步通过动物实验证实,强反应性抗原PscF在小鼠上具有良好的免疫原性,且攻毒保护率为95%,提示其是良好的PA候选抗原。这些结果为下一步成功研制PA新型疫苗提供了新的实验依据,对PA感染的防控具有积极的意义。