论文部分内容阅读
研究目的本研究建立硬皮病样慢性移植物抗宿主病（sclerodermatous chronic graft versus host disease,scl-cGVHD）小鼠模型并给予20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg三种剂量的芒果甙（mangiferin,MF）干预,在体内实验中初步探讨Nrf2激活剂——MF对小鼠scl-cGVHD的影响及作用机制。研究方法以10-12周龄BALB/c雄性小鼠、10-12周龄CB6F1雌性小鼠为供鼠,10-12周龄CB6F1雌性小鼠为受鼠。将受鼠随机分为对照组、同基因造血干细胞移植组（syngeneic hematopoietic stem cell transplantation,synHSCT）、异基因造血干细胞移植+溶剂（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo HSCT+vehicle）组、异基因造血干细胞移植+20mg/kg MF（allo HSCT+20mg/kg MF）组、异基因造血干细胞移植+50mg/kg MF（allo HSCT+50mg/kg MF）组、异基因造血干细胞移植+100mg/kg MF（allo HSCT+100mg/kg MF）组。每组5只小鼠。受鼠经8.0Gy全身照射后,4-6小时内经尾静脉注入CB6F1雌性小鼠骨髓细胞（8×106）及脾脏细胞（7×107）混悬液建立synHSCT模型,输入BALB/c雄性小鼠骨髓细胞（8×106）及脾脏细胞（7×107）混悬液建立allo HSCT（即scl-cGVHD）模型。造血干细胞移植后第1-14天,分别根据小鼠体重给予allo HSCT+20mg/kg MF组、allo HSCT+50mg/kg MF组、allo HSCT+100mg/kg MF组20、50、100mg/kg芒果甙,给予allo HSCT+vehicle组等体积的羧甲基纤维素钠溶剂。每日灌胃一次。造血干细胞移植后第33天处死所有小鼠。根据小鼠临床cGVHD评分（体重、皮肤损伤、弓背）和靶器官（皮肤、肝脏、脾脏、回肠）组织学分析评价cGVHD严重程度。通过活性氧（reactive oxygen species,ROS）试剂盒检测小鼠外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）的氧化活性水平。采用实时定量RT-PCR和western blot检测肝脏组织和骨髓细胞中Nrf2、NQO1、HO-1的m RNA水平和蛋白质表达水平。采用流式细胞术检测小鼠脾脏单个核细胞（splenic mononuclear cells,SMNCs）中CD19+B细胞及CD19+CD5+CD1dhiBregs水平。使用Luminex检测小鼠血浆中促炎、促纤维化因子白介素-6（interleukin-6,IL-6）和白介素-17A（interleukin-17A,IL-17A）水平。所有计量资料采用双侧t检验,以均数±标准误表示。所有计数数据采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.MF显著减轻小鼠scl-cGVHD临床症状（1）体重变化:+18-+33d（即cGVHD期）,对照组、synHSCT组小鼠体重稳定缓慢上升;allo HSCT+vehicle组小鼠体重持续下降,始终低于对照组及synHSCT组（P<0.05）;MF显著增加scl-cGVHD小鼠体重,作用呈剂量依赖性（P<0.05）。（2）皮肤损伤:cGVHD期,根据国际通用小鼠cGVHD皮肤评分标准对各组小鼠皮肤损伤进行评分。对照组、synHSCT组小鼠评分为0;allo HSCT+vehicle组小鼠出现典型皮肤损伤（脱毛、结痂）,评分显著高于对照组、synHSCT组（P<0.05）;MF显著降低scl-cGVHD小鼠皮肤损伤评分,作用呈剂量依赖性（P<0.05）;（3）弓背状态:cGVHD期,对照组、synHSCT组小鼠未出现弓背;allo HSCT+vehicle组有4只小鼠出现运动性弓背;allo HSCT+20mg/kg MF组有3只小鼠出现运动性弓背;allo HSCT+50mg/kg MF组有1只出现运动性弓背;allo HSCT+100mg/kg MF组无小鼠出现运动性弓背;（4）临床评分:cGVHD期,根据以上三种临床表现对各组小鼠进行cGVHD临床评分。对照组、synHSCT组小鼠评分为0;allo HSCT+vehicle组小鼠评分显著高于对照组、synHSCT组（P<0.01）;MF显著降低scl-cGVHD小鼠cGVHD临床评分,作用呈剂量依赖性（P<0.05）;2.MF显著减轻scl-cGVHD靶器官损伤（1）H&E染色:对照组、synHSCT组小鼠各靶器官组织形态正常;allo HSCT+vehicle组小鼠各靶器官呈慢性炎症改变:皮肤真皮层增厚,回肠肠壁肌层增厚,肝脏、脾脏正常结构被破坏,各靶器官均出现大量单个核细胞浸润;allo HSCT+MF组小鼠皮肤厚度、小肠肠壁肌层厚度与对照组、synHSCT组相当,肝脏、脾脏组织形态正常,各靶器官无明显单个核细胞浸润;（2）Masson三色法染色:对照组、synHSCT组小鼠各靶器官未出现病理性纤维化;allo HSCT+vehicle组小鼠各靶器官均存在大面积胶原沉积,纤维化程度显著增高（P<0.05）;MF显著降低scl-cGVHD小鼠各靶器官纤维化程度（P<0.05）;3.MF显著降低scl-cGVHD小鼠PBMCs中ROS水平（1）与synHSCT组相比,allo HSCT+vehicle组小鼠ROS水平显著升高（P<0.0001）;（2）MF显著降低scl-cGVHD小鼠ROS水平（P<0.001）;4.MF显著提高scl-cGVHD小鼠肝脏、骨髓中Nrf2抗氧化通路转录及表达水平（1）表达水平:在肝脏组织中,与synHSCT组小鼠相比,allo HSCT+vehicle组小鼠肝脏Nrf2,NQO1及HO-1蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）;MF显著提高scl-cGVHD小鼠肝脏Nrf2,NQO1,HO-1蛋白表达水平,且作用呈剂量依赖性（P<0.05）;在骨髓细胞中,与synHSCT组小鼠相比,allo HSCT+vehicle组小鼠骨髓Nrf2,NQO1及HO-1蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）;MF显著提高scl-cGVHD小鼠骨髓Nrf2,NQO1,HO-1蛋白表达水平,且作用呈剂量依赖性（P<0.05）;（2）转录水平:在肝脏组织中,与synHSCT组小鼠相比,allo HSCT+vehicle组小鼠肝脏Nrf2,NQO1及HO-1 m RNA水平均显著降低（P<0.01）;MF显著提高scl-cGVHD小鼠肝脏Nrf2,NQO1,HO-1 m RNA水平,且作用呈剂量依赖性（P<0.05）;在骨髓组织中,与synHSCT组小鼠相比,allo HSCT+vehicle组小鼠骨髓Nrf2,NQO1及HO-1 m RNA水平均显著降低（P<0.01）;MF显著提高scl-cGVHD小鼠骨髓Nrf2,NQO1,HO-1 m RNA水平,且作用呈剂量依赖性（P<0.05）;5.MF显著提高scl-cGVHD小鼠SMNCs中Bregs水平（1）与对照组、synHSCT组小鼠相比,allo HSCT+vehicle组小鼠SMNCs中CD19+B细胞水平无显著性差异（P>0.05）;MF对scl-cGVHD小鼠SMNCs中CD19+B细胞水平无影响（P>0.05）;（2）与对照组相比,synHSCT组、allo HSCT+vehicle组小鼠CD19+B中CD19+CD5+CD1dhiBregs水平均显著下降（P<0.01）;MF显著提高scl-cGVHD小鼠CD19+B中CD19+CD5+CD1dhiBregs水平,且作用呈剂量依赖性（P<0.05）;6.MF显著降低scl-cGVHD小鼠血浆IL-6、IL-17A表达（1）与对照组、synHSCT组相比,allo HSCT+vehicle组血浆IL-6水平显著升高（P<0.01）;MF显著降低scl-cGVHD小鼠血浆IL-6表达,且作用呈剂量依赖性（P<0.05）;（2）与对照组、synHSCT组相比,allo HSCT+vehicle组血浆IL-17A水平显著升高P（P<0.05）;MF显著降低scl-cGVHD小鼠血浆IL-17A表达,且作用呈剂量依赖性（P<0.05）。研究结论芒果甙可在scl-cGVHD小鼠体内以剂量依赖性的方式激活Nrf2抗氧化通路、提高Bregs水平、下调IL-6和IL-17A水平,减轻scl-cGVHD。芒果甙可能通过增强小鼠抗氧化抗炎防御机制以及调节自身免疫反应的机制发挥防治cGVHD作用。