造血系统发育是胚胎发育的重要环节,其发育异常会导致造血功能紊乱,人类许多疾病的发生与造血系统发育异常密切相关。血细胞来源于血液祖细胞,后者起源于胚胎发育阶段的中胚层,其进一步发育可产生原始血细胞与造血干细胞。原始血细胞参与初级造血,造血干细胞则调控定向造血分化产生成熟的各系血细胞。造血系统的正常发育依赖于一个复杂的分子信号调控网络,这其中任何关键分子出现调控异常都可能导致严重的发育缺陷。研究相关分子的具体作用和调控机制对于理解血液发育过程的分子信号调控网络十分重要,也可为深入了解造血系统发育异常所导致的相关疾病发病机制、探究有效的治疗方案提供新的分子靶点。第一部分Cul4a促进斑马鱼初级造血红系发育斑马鱼是研究造血系统发育的理想模型。为探究Cul4a在造血系统发育中的作用,我们首先分析了 Cul4a在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达谱,并利用Morpholino和CRISPR/Cas9技术在胚胎中敲低或敲除cul4a基因,初步探究cul4a对初级造血红系、髓系发育及定向造血的影响,取得了以下研究结果:(1)收取受精后不同时间点(单细胞期、胚盾期、6体节期、受精后24小时及受精后48小时)的斑马鱼胚胎,采用整胚原位杂交(whole-mount situ hybridization,WISH)检测发现cul4a在胚胎发育早期全身广泛性表达,且在初级造血发育的关键部位——受精后12小时(12 hours post fertilization,12 hpf)的胚胎后部侧板中胚层(posterior lateral plate mesoderm,PLPM)及 24 hpf 的中间细胞团(Intermediate cell mass,ICM)有明显高表达,这为cul4a参与调控初级造血系统发育提供了必要前提,提示cul4a可能在斑马鱼胚胎初级造血系统的发育中发挥重要功能。(2)本课题组前期已经明确斑马鱼cul4在进化上高度保守,敲低cwl4a基因导致心脏及胸鳍发育异常,而cul4b基因不具有明确的生物学功能。为明确cul4a是否在造血系统尤其是初级造血中发挥作用,我们采用Morpholino技术敲低cul4a基因表达,分析其功能丧失条件下在斑马鱼胚胎早期造血系统发育的表型。普通光学显微镜下观察发现,敲低cul4a的胚胎胸前循环区的血细胞较对照数目明显减少。邻联茴香胺(o-dianisidine)染色显示敲低cul4a后血红蛋白表达明显减少,WISH 及实时荧光定量 PCR(quantative real-time PCR,qRT-PCR)结果显示红细胞特异性标记物hbbe3表达量也显著降低。拯救实验表明cul4a mRNA能够有效拯救这种异常表型,说明红细胞减少确实是由敲低cul4a导致的特异性表型。接下来,WISH、qRT-PCR检测基因表达以及Tg(gata1:EGFP)转基因斑马鱼在体荧光实验中发现红系前体细胞标记物gatal随着cul4a敲低而表达降低。外源性gata1 mRNA能够有效拯救cul4a敲低导致的上述异常表型。另一方面,WISH及qRT-PCR检测初级造血髓系标记物pw.1、mpo及定向造血标记物runx1、cmyb的表达情况,发现它们均不受cul4a敲低影响。这说明敲低cul4a会导致斑马鱼胚胎红细胞数目明显减少,初级造血红系发育缺陷,但不影响初级造血髓系发育及定向造血。由于Morpholino会引起细胞凋亡等非特异性表型,且斑马鱼抗体匮乏导致其监测手段的局限性,我们应用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼cul4a及cul4b基因做了敲除。采用优化的四条高效sgRNA联合共注射的方法得到cul4a、cul4b单敲及cul4a/cul4b双敲的基因突变纯合子胚胎,分析cul4a及cul4b对斑马鱼胚胎早期造血系统发育的影响。o-dianisidine染色检测显示cul4a单敲或者cul4a/cul4b双敲均导致血红蛋白表达明显减少,WISH及qRT-PCR结果显示红细胞特异性标记物hbbe3表达量也显著降低。拯救实验显示这种异常表型能够被cul4a mRNA有效拯救,说明敲除cul4a基因导致了上述特异性表型。与此同时,cul4a、cul4b单敲及cul4a/cul4b双敲均不影响pu.1及runx1表达。该体系中,cul4b基因单敲的斑马鱼胚胎没有出现明显异常表型。综上,本部分结果表明Cul4a对红系前体细胞标记基因gata1存在调控作用,参与调节斑马鱼初级造血红系发育,但对初级造血髓系发育及定向造血没有影响。此外,与之前研究成果相一致,斑马鱼cul4b在胚胎造血系统发育过程中没有表现出明确的生物学功能,也不能代偿cul4a功能。第二部分 Cul4a调控血液祖细胞正常分化第一部分的研究结果说明Cul4a对于斑马鱼初级造血红系发育至关重要,敲低cul4a导致红细胞显著减少。那么,Cul4a特异性调控初级造血红系发育的具体机制是什么?为何对髓系发育及定向造血没有影响?为了回答这些问题,结合红细胞分化发育过程,我们从三方面对Cul4a参与调控初级造血红系发育的可能机制进行了分析:(1)利用磷酸化组蛋白H3特异性抗体进行免疫组织化学染色,结果发现cul4a敲低组胚胎ICM区域的增殖细胞数目与对照相比没有显著性差异,这说明敲低cul4a对红系发育的影响可能不是通过影响初级造血细胞的增殖;(2)有文献报道,注射Morpholino会激活斑马鱼中的p53通路,诱发细胞凋亡。为了排除这种非特异性因素的干扰,我们首先用Western Blot和qRT-PCR检测cul4a-MO注射组与CoMO注射组胚胎的p53表达量,发现其在蛋白及RNA水平表达无差异。接着利用TUNEL染色对胚胎细胞凋亡情况进行检测,发现ICM区的细胞凋亡数目在cul4a敲低组与CoMO对照组之间没有显著性差异,这说明敲低cul4a不影响初级造血细胞的凋亡水平;(3)造血系统发育过程中血液祖细胞具有多向分化潜能,既然cul4a不影响红系细胞的增殖及凋亡水平,那么是否影响了血液祖细胞的分化?cul4a基因表达水平的变化是否影响血液祖细胞内部决定不同命运转化的转录因子表达?我们首先利用WISH及qRT-PCR检测初级造血细胞形成的最早标记物scl,结果发现敲低cul4a导致scl在胚胎6体节期及24 hpf的ICM区表达量均显著降低。这说明敲低cul4a导致初级造血细胞分化起始便出现了异常。同时,另一血液祖细胞标记物lmo2也随cul4a敲低而表达降低。有文献报道scl两个转录本scl-α与scl-β在初级造血及定向造血发育过程中发挥不同功能。由于敲低cul4a表现出红系特异性表型,我们用qRT-PCR方法检测敲低cul4a后斑马鱼胚胎scl-α及scl-β表达水平变化。结果发现注射cul4a-MO后scl-α mRNA水平明显降低,而scl-β mRNA水平没有变化,这提示我们Cul4a可能特异性影响scl-α转录本表达。接着我们用外源性scl-α及scl-β mRNA对cul4a敲低异常表型进行拯救。WISH及qRT-PCR检测血红蛋白及红系标记物hbbe3表达量,发现只有scl-αmRNA能够明显恢复其表达水平,而scl-β没有拯救功能,这说明Cwl4a对scl-α有特异性调控作用。在cul4a单敲及cul4a/cul4b双敲胚胎中我们也发现scl及lmo2表达量均显著降低,而在cul4b单敲胚胎中表达没有变化。有意思的是,我们还发现lmo2在cul4a敲低后表现的表达下调同样能够被scl-α mRNA有效拯救。本部分结果说明在斑马鱼初级造血系统发育的调控网络中,cul4a处于早期造血标记物scl上游,cul4a通过特异性调控scl-α影响初级造血祖细胞的正常分化,进而参与红系发育过程的调控。第三部分Cul4a调控scl和gata1基因表达的分子机制本课题组前期研究显示Cul4a可以直接结合于Tbx5基因的启动子区域实现对其表达的调控。为明确Cul4a调控scl-α表达的分子机制,我们利用斑马鱼整胚染色质免疫共沉淀(whole embryos chromatin immunoprecipitation,E-ChIP)方法分析Cul4a在%scl--α启动子区的结合情况。我们在scl-α转录起始位点上游-2000 bp～+200 bp之间设计了 6对引物,利用Cul4a抗体进行了 E-ChIP实验,发现Cul4a可以结合于scl-α转录起始位点上游-1643 bp～-1143 bp区域,同时该区域三甲基化修饰的组蛋白H3K4(H3K4me3)明显富集,并且当cwl4a低表达时H3K4me3水平也随之明显降低。这些结果说明Cul4a结合在scl-α基因启动子区域,可能通过促进H3K4三甲基化修饰对scl-α基因发挥转录激活功能,进而调控初级造血红系发育。敲低cwl4a导致scl及gata1表达量降低,而pu.1表达没有变化。Cul4a表现出对红系的特异性调控功能。为确定cwl而是否直接调控红系特异性转录因子gata1,我们在gata1转录起始位点上游-2000 bp～+200 bp之间设计了 7对引物,利用Cul4a及H3K4me3抗体进行了 E-ChIP实验。结果发现Cul4a可以结合于gata1转录起始位点上游-1059 bp～-538 bp区域,同样检测到该区域高水平的H3K4me3,随着cul4a基因表达下调H3K4me3水平也随之降低。这说明Cul4a可以结合在gata1基因启动子区域,通过促进H3K4me3直接影响gata1基因表达,从而特异性影响红细胞发育。综上所述,Cul4a通过促进组蛋白H3K4me3直接调控scl-α及gata1基因转录活性,从而影响斑马鱼初级造血红系发育。