利用玉米MCK1为分离探针从烟草中分离到两同源基因（NtCBK1／2）。利用原核和真核的表达系统表达这两个蛋白，并研究了其生化性质；结果证明两蛋白均为钙调素结合蛋白激酶。利用转基因方法研究NtCBK1／2生物学功能，发现NtCBK1介导烟草开花调控。主要结果如下： 1．钙调素结合功能的鉴定：利用原核表达系统分别表达两烟草钙调素结合蛋白激酶全长序列。以生物素标记的钙调素为探针，利用Western blot的方法，研究这二个蛋白同钙调素的相互作用。研究结果表明，二者可以在有钙离子存在的情况下结合钙／钙调素，但是在EGTA存在的情况下，不结合钙调素，从而证明了两烟草钙调素结合蛋白激酶均具有钙依赖性的钙调素结合能力；另外，以生物软件分析初步确定了两烟草钙调素结合蛋白激酶的钙调素结合区。在这基础上进一步利用大肠杆菌表达两烟草钙调素结合蛋白激酶基因的不同长度的蛋白缺失体，以生物素标记的钙调素为探针进行Western blot分析，通过实验确定了两个蛋白的钙调素结合区。 2．激酶生化特性分析：利用真核细胞表达系统BAC To BAC表达系统表达两烟草钙调素结合蛋白激酶，并经Ni-NTA和CaM-sepharose两步纯化后，用于激酶活性的分析。结果表明，两钙调素结合蛋白激酶的自磷酸化和底物磷酸化均不依赖于钙调素，其磷酸化的位点为丝氨酸和苏氨酸。说明烟草钙调素结合蛋白激酶是一种钙调素结合的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。为了排除蛋白激酶在表达纯化的过程中可能发生的自磷酸化或者是被其他的蛋白激酶磷酸化的可能性，将表达纯化后的蛋白激酶用蛋白质去磷酸化酶处理后再进行激酶活性的分析，分析的结果同前面的结果一致。同时，利用毛细管电泳的方法研究蛋白激酶的磷酸化位点的时候发现，从昆虫细胞中纯化出来的蛋白激酶并没有被磷酸化。对于NtCBK1，尽管其活性不需要Ca²⁺/CaM，但是当反应物中加入Ca²⁺/CaM时，对蛋白激酶的活性的刺激可达到3-4倍，不同的钙调素对NtCBK1酶活的影响差别不大。对于NtCBK2，它的酶活也被Ca²⁺/CaM激活，但不同的钙调素对它的影响并不相同。其中，NtCaM1对它酶活只激活3倍，而NtCaM3和NtCaM13可激活酶活9-10倍。同时，我们发现不同的钙调素与NtCBK2结合能力不同，NtCaM3和NtCaM13与NtCBK2结合强度大于NtCaM1。综上所述，烟草钙调素结合蛋白激酶是一种新型的钙调素结合的蛋白，即具有结合钙调素的特性，同时是一种钙调素刺激的蛋白激酶，这在植物中的钙调素结合蛋白中是首次发现。 3.价C万人了的表达模式分析:研究表明NtC刀人万的表达具有时空性。在营养器官中，NtCBKI的mRNA多分布于细胞分裂旺盛、代谢活跃的组织和细胞中。尤其在花启动过程中NtC旧大万表达受到特异调控。在花决定时期的顶端分生组织和幼花原基几乎检测不到一价C男大刀的表达，而在此阶段之前的营养生长时期的顶端分生组织和花原基分化而来的花器官原基都有较强的从C万人万表达。此外，还构建了烟草GFP标记的NtCB人万启动子表达载体，转化烟草用于分析NtCBKj在烟草细胞内的分布，检测到花发育时期GFP在叶芽的分布也呈现出一个波动过程。两部分结果均显示开花启动时NtC刀大7表达受到抑制。 4.利用转基因烟草研究NtC刀人7在烟草生长发育过程中的功能:将NtCBKI基因。厅C酬口)和反义（价乙酬口刁）分别构建到pMD一1载体上，通过农杆菌叶盘转化法获得转基因烟草植株，并进行进一步分析。研究结果表明转NtCBKI的植株营养生长的时间延长，其中一部分烟草表现为晚开花，一部分甚至没开花，但转反义的植株和正常植株没有差别。S。uthern杂交显示转基因不同株系从C刀大万在烟草基因组中的插入位点不同，故而转化植株的表型改变不是由于插入位点的基因激活/失活造成的。Northern杂交分析显示转基因植株中价CB大J过量表达程度不同，并且价C万人万的表达水平与转化植株的表型改变程度相关:开花延迟时间长的，NtCB大甘表达量也高。这些证据表明转化植株的表型改变是转入的NtCB人万导致其过量表达的结果，并且发现这种表型在第二代和第三代稳定遗传。结合NtCBKI在开花启动过程中被抑制表达，说明NtCBKI在烟草的开花调控中起着重要作用。