论文部分内容阅读
背景 多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是B淋巴细胞的恶性肿瘤，发病率居血液系统恶性肿瘤第二位。虽然大剂量化疗联合自体干细胞移植较传统化疗有更好的治疗效果，但是鲜有患者能够达到持续的长期缓解，浆细胞凋亡受阻在其发病及对化疗药物耐药机制中起了决定性作用。三氧化二砷（As2O3）已成功地用于急性早幼粒细胞白血病（APL）的治疗，越来越多的证据表明砷剂的抗肿瘤作用并不仅限于白血病，As2O3治疗各类恶性肿瘤已成为近几年肿瘤研究的热点。砷剂治疗APL的机制主要是诱导分化和促进白血病细胞凋亡，但这不能完全解释它对其它肿瘤细胞的作用，其具体机制有待进一步的阐明。核因子κB（nuclear factor-κ「浙江大学医学院硕士学位论文JB，NF一KB）包括一个转录因子家族，参与炎症反应、免疫应答、细胞增殖分化及细胞凋亡的转录调控，NF一B活性的失调能引起包括肿瘤和炎症在内的多种人类疾病。多种实体瘤细胞中都可观察到有NF一B的持续激活，在人骨髓瘤细胞株和骨髓瘤患者骨髓单个核细胞中也发现有NF一B活性异常升高，以抗凋亡及维持细胞增殖。本研究观察As203对MM细胞株KM3、RpM工8226细胞的作用，探讨砷剂细胞毒作用机制。 材料和方法 人骨髓瘤细胞株KM3和RPM工8226由浙江大学医学院血液病研究所提供。实验设定细胞培养中加入不同浓度的AsZO3为实验组，细胞培养中不加ASZO3为空白对照组，不加As203和特异性一抗为阴性对照组。根据预实验结果及文献报道，设定实验中AsZO3的浓度梯度为O，0.5，1，2，5，10和20 umol/1，检测时间点选择在培养后24小时。 通过绘制生长曲线观察砷剂在体外对KM3和RPM工8226细胞的增殖抑制作用，以MTT法测定不同浓度砷剂对细胞的抑制率并求得其24小时的半数抑制浓度（IC5o）。用流式细胞术（flow eytometry，FCM）测定砷剂对细胞的诱导凋亡作用及细胞周期分析，同时测定细胞浆内工KB一a蛋白的变化。用间接免疫荧光法进一步观察砷剂作用前后工KB一蛋白改变及定位，并用Western印记法检测两种细胞胞核内P65蛋白的表达。 结果 研究结果表明AsZ飞对2种人骨髓瘤细胞株KM3和RPM工8226均有增殖抑制作用，并且都呈剂量依赖性，KM3和即M工8226的24小时的半数生长抑制浓度IC50值分别为9.61 umol/1及8.01 umol/l。FCM结果表明0.520 umol/1的AsZO3作用24小时后上述2种细胞株凋亡率均有不同程度的增高，砷剂浓度在10 umOI/1时己出现明显的凋亡，浓度增至20 umol/1时KM3和RPM18226的凋亡率分别达到了r浙江大学医学院硕士学位论文J41.ISryo和65.25%。砷剂作用KM3后分析细胞周期变化，GZ/M期细胞比例由13.74%升至41.72%，S期细胞比例则由35.H%降至23.96%。 FCM间接荧光法结果表明AsZO3作用骨髓瘤细胞后胞浆中1 KB一a蛋白阳性表达率明显减少，KM3由对照组的76.68士3.71%减少到10 umol/1时的51.57士4.20%(尸（0.01），RPMI8226由对照组的79.72士3.56%减少到10 umol/1时的34. 08士3.70%（P<0.01），且此降解作用呈剂量依赖性。用间接免疫荧光法观察空白对照组的骨髓瘤细胞，细胞内工KB一a在荧光显微镜下呈现明亮的黄绿色荧光，多呈环状分布于整个胞浆中，10 umol/1的As203诱导细胞后，胞浆中荧光强度明显减弱。Western印迹法显示2种细胞均有NF一KB的持续活性表达，AS203作用后呈剂量相关性蛋白表达降低。结论 AS203对人骨髓瘤细胞株KM3和RPM工8226均有增殖抑制和诱导凋亡作用，且在本实验浓度范围内呈剂量依赖性。其机制和抑制骨髓瘤细胞NF一KB活性、下调NF一B基因产物表达有关。砷剂同时影响细胞周期，使GZ/M期转换延长从而抑制细胞增殖。