糖尿病是一种严重影响生活质量、能够引发多种致命并发症的慢性疾病，目前在全世界范围内呈流行态势。2型糖尿病是糖尿病的主要类型，胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要特征和前提，而肥胖则是其最重要的发病因素之一。长期以来，学者们一直认为肥胖患者体内过度积聚的脂肪细胞能够分泌多种脂肪介素(adipocytokine)，如游离脂肪酸(Free Fatty Acids，FFA)、肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor α，TNFα)、Leptin、Adiponectin等，参与胰岛素抵抗的发生，并试图从中寻找糖尿病防治的新靶标，均未获满意结果。 Resistin是近年来通过差减杂交实验发现的另一种重要的胰岛素抵抗候选分子，主要由脂肪细胞分泌，并在脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞分化过程中表达逐渐增强。饮食性或遗传性肥胖小鼠及肥胖患者血浆Resistin浓度明显升高，禁食或TZDs类抗糖尿病药物应用后其血浆浓度及体外培养脂肪细胞中Resistin表达丰度均明显降低。重组Resistin能使正常小鼠出现明显胰岛素抵抗症状，而Resistin抗体的应用则能显著改善之。因此，Resistin已被认为是联系肥胖与2型糖尿病的纽带，并有望成为2型糖尿病治疗的潜在靶标。 然而也有一些文献报道，2型糖尿病患者、肥胖伴胰岛素抵抗患者与正常人相比，血清Resistin浓度并无明显差异，认为Resistin与胰岛素抵抗的发生无关。为明确两者之间的关系，本文选择对肥胖发 南京医科大学博士毕业论文生具有不同易感性的大鼠为研究对象，制备了饮食诱导肥胖(diet一indueed obesit又nlo)与饮食抵杭(diet resistanee，DR)大鼠模型，通过检测外周白色脂肪组织中Resistin的表达水平，探讨了Resistin与血糖、血清胰岛素及其它生化指标之间的关系。结果发现，各组间血糖、血脂、血清胰岛素水平虽无显著差异，但由于DIO组大鼠外周白色脂肪组织中Resistin mRNA表达水平显著高于DR组，与其它胰岛素抵抗发生相关基因如ppARY、TNFa、LePtin的表达趋势一致，因此支持Resistin参与胰岛素抵抗机制的观点。至于各组间血糖、血脂、血清胰岛素水平未出现显著差异的原因，可能与肥胖模型制备时间偏短，尚未出现胰岛素抵抗症状有关。 脂肪细胞分化与胰岛素抵杭发生关系密切。分析Resistin基因序列发现，其启动子区及内元序列中含有多个促进脂肪细胞分化关键转录因子的结合位点，提示Resistin可能具有促进脂肪细胞分化的作用。然而文献报道重组Resistin及其家族成员RELMa(Resistinl议emolecule的均明显抑制脂肪细胞分化，为此本文首次将大鼠Resistin基因表达载体转染3T3一Ll细胞，观察对脂肪前体细胞分化的影响，结果发现Resistin能够促进3T3一Ll细胞分化，而特异性RNA干涉(RNA interferallce)表达载体的转染则明显抑制其分化。为解释二者差异，进一步用软件进行Resistin结构分析与亚细胞定位预测发现，该蛋白含有多个潜在的磷酸化位点、跨信号肤区含有一个典型的亮氨酸拉链结构(Let:eine zipper pattern)，且具有核定位可能，据此推测Resistin蛋白前体(prectlrsor)有可能作为转录因子直接进入细胞核， 南京医科大学博士毕业论文发挥促进脂肪前体细胞分化的作用。因此本研究将大鼠Resistin基因全编码区插入pEGFP一NZ亚细胞定位表达载体，观察3T3一Ll细胞分化前与分化过程中Resistin亚细胞定位的变化，发现Resistin并不具备核定位功能。然而本研究首次发现分泌到细胞外的Resistin主要以三聚体的形式存在，同时还具有其它聚合形式，不同于先前研究报道的分泌型Resistin主要以二聚体形式存在并具有抑制3T3一Ll细胞分化作用的结论，提示不同聚合状态的Resistin可能通过激活不同信号转导通路发挥生理功能，三聚化的Resistin可能是促进3T3一Ll细胞分化的重要原因。另外，Resistin蛋白序列中多个磷酸化位点的存在也提示不同磷酸化状态可能对Resistin功能具有重要影响。基因突变是一种很小概率事件，但却是研究蛋白质结构与功能关系的重要手段。本研究通过Resistin基因直接测序，从DR大鼠体内首次发现一个位于信号肤内的错义突变LetlgVal(C25G)位点，该位点并不影响突变型Resistin的分泌功能，但却能够明显抑制3T3一Ll细胞的分化，提示Resistin结构与功能之间的关系较为复杂，该突变位点的发现对于今后进一步的Resistin结构与功能研究具有重要的意义。 Resistin必须与靶细胞上的受体或相关蛋白结合才能发挥其生理功能，然而至今尚无任何有关Resistin相关蛋白的报道。本研究首次采用噬菌体表面展示(Phage DisPlay)技术，筛选出了三条5’末端含有相同11bp碱基的cDNA片段，所有cDNA片段均不含有开放阅读框(Open Reading Frame，O即)，均被l一2个TGA终止密码子所阻断，提示可能发生了终止密码读通现象(Readthrough)。采用嗜菌斑印迹 南京医科大学博士毕业论文(PlaqLle Lift Assay)技术成?