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云芝[Corilus versicolor(L.er.Fr.)Qu’ei.]是一种世界性分布的药用真菌。云芝多糖肽具有明显的抗肿瘤、改善免疫功能、降血压、抗炎等功效。中医认为云芝具有扶正固本、补益精气的作用。本论文对云芝Cov-1菌株的选育、发酵条件的优化等方面进行了系统研究,同时对云芝糖肽的复方制剂-芝参正肝胶囊的提取工艺进行了研究。
1.研究了酶种类、酶浓度、酶解温度和时间、渗透压稳定剂、pH值及菌龄等因素对云芝原生质体制备以及不同再生培养基对云芝原生质体再生的影响。结果表明,菌龄3 d的云芝菌丝体用3%溶壁酶,以pH 5.5、0.4 mol/L的KCI为稳定剂,30℃酶解5 h获得的原生质体产量最高;用RM1再生培养基培养,原生质体再生率最高。
2.采用云芝原生质体紫外诱变方法,从出发菌株筛选出一株遗传上相对稳定的适应液体培养的云芝诱变菌株——YBUV113,该菌株在综合PDA斜面上生长速度较快,长势旺盛。在液体培养基中发酵生长迅速,菌丝湿重、干重和多糖产量均与出发菌株相当。
3.碳、氮源是影响液体培养云芝菌丝体生长的重要因素。其中,玉米粉是其适合碳源,黄豆饼粉为其适合氮源。实验确定了云芝深层培养的较适合的培养基组成为:玉米粉2%,黄豆饼粉2%,KH2PO40.3%,K2HP040.3%。最佳摇瓶培养条件为:培养基起始pH5.5,接种量20%,摇床转速180r/min,培养3天。在上述条件下,每升发酵液可获得干菌丝体34.5g/L。糖含量53.74%,蛋白含量18.36%。
4.芝参正肝是云芝糖肽的复方制剂,由云芝糖肽、丹参、三七、赤芍、葛根、银杏叶6味中药组成的现代中药复方制剂。本文对芝参正肝提取纯化工艺进行了研究,通过提取方法的比较和正交试验确定了芝参正肝提取方法及其优化工艺条件。结果,渗漉提取最佳工艺条件为:药材粉碎成粗粉,用14倍药材重量的70%亿醇渗漉,渗漉速度为1mL/min;大孔树脂纯化最佳工艺条件为:上柱提取液浓度为200mg/mL,上柱流速3Bv/h,洗脱时采用60%乙醇,体积为3Bv,洗脱流速为3Bv/h。由最佳工艺提取的芝参正肝原料中有效成分丹酚酸B、芍药苷、人参皂苷Rgl和银杏总黄酮之和为45%。