肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌的90%,因其异质性和复杂性,已成为一种高死亡率的原发性肝癌[1]。肝癌的恶性程度高且易转移和复发,目前肝癌的治疗又缺乏有效的手段,使得肝癌患者预后很差,5年总体平均生存率仅5%-30%。原发性肝癌的发病机制极其复杂,涉及一系列的基因和细胞因子,肝炎病毒感染（我国主要是乙型肝炎病毒）和黄曲霉素摄入过量等被认为是肝癌最常见的诱因。大量研究表明,肿瘤的起始和进展是由代谢重编程驱动的,而HCC在糖代谢、脂代谢及蛋白质代谢方面明显不同于正常肝组织。因此,从代谢异常的角度去深入研究HCC发生和发展的病理机制,并通过靶向异常代谢治疗HCC可能是今后HCC研究的重点和发展方向。低密度脂蛋白受体相关蛋白1（low-density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP1）是LDLR家族的一员,广泛分布于各种组织和器官中。LRP1由一条515 k Da的α链和一条85 k Da的β链以非共价键组成,前者可与胞外配体结合,后者参与胞吞作用和细胞内信号传导。本课题组在前期研究中发现,LRP1通过调控巨噬细胞胆固醇转运相关的ATP结合盒转运蛋白（ABCA1）表达抑制动脉粥样硬化的形成。此外,LRP1在肝细胞胰岛素信号转导及高脂诱导脂肪性肝炎和胰岛素抵抗的形成中也扮演重要角色。研究表明,LRP1在癌症的形成中也发挥作用,其作用机制可能与以下几个方面有关:1)LRP1作为一种胞外基质降解酶受体,通过与胞外基质降解酶结合进而清除基质降解酶来发挥调节作用,包括基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、蛋白酶抑制剂复合物和内糖苷酶肝素酶等;2)通过结合包括生长因子在内各种胞外配体及与胞内衔接蛋白相互作用,参与细胞各种级联信号的调控;3)肿瘤组织中LRP1的表达水平通常下调,低LRP1表达一般被认为是不良预后因素之一,而LRP1在脑组织肿瘤中相反出现上调。因此,LRP1具体发挥抑癌或是促癌作用可能取决于肿瘤细胞的类型以及参与这些过程的特异性蛋白。尽管有研究发现,LRP1低表达与肝癌迁移和不良预后相关,但其具体机制并不清楚。本课题将通过肝癌细胞模型、小鼠HCC模型及临床肝癌组织标本为研究对象,系统性研究LRP1在肝癌组织和肝癌细胞中的表达变化,及LRP1的表达改变如何影响肝癌细胞的增殖、侵袭、转移和HCC的形成,并进一步揭示其作用的具体分子机制。实验方法:1.首先通过CPTAC（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium）数据库分析LRP1在10种恶性实体肿瘤中癌组织与癌旁组织蛋白水平表达差异,包括肝癌。通过GEO三个独立数据库分析LRP1 m RNA在肝癌组织和癌旁组织表达差异,分析LRP1与肝癌恶性程度及患者预后的关系。采用蛋白免疫印迹（Western Blot）和免疫组化（immuno-histochemistry,IHC）实验比较LRP1在临床收集到的32例肝癌患者的肝癌组织和癌旁组织中表达的差异。2.通过BALB/c小鼠肝癌细胞皮下移植成瘤模型,观察LRP1对肿瘤生长差异的影响:构建携带针对人和小鼠LRP1基因c DNA的3’UTR序列的sh RNA干扰序列的p LKO.1慢病毒质粒,Scramble sh RNA作为对照sh RNA,采用p LKO.1系统制备慢病毒感染肝癌细胞构建LRP1敲低稳定细胞株,皮下注射LRP1敲低的H22小鼠肝癌细胞和对照H22小鼠肝癌细胞,连续观察21天,记录皮下移植瘤体大小;21天后剥离移植瘤,称量。比较肿瘤体积和增长速度。体外肝癌细胞生物学功能实验观察LRP1对肿瘤增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响:采用慢病毒感染Hep G2细胞构建LRP1敲低稳定细胞株,利用MTS实验、细胞克隆形成实验、划痕实验、Transwell侵袭实验观察LRP1对肿瘤细胞生长的影响,采用流式细胞技术观察LRP1对肿瘤细胞凋亡的影响,验证体内实验结果。通过Western Blot检测LRP1对细胞增殖和凋亡相关基因的表达差异。3.LRP1影响肝癌进展的机制研究。利用Western Blot检测LRP1对整体O-糖基化（O-Glc NAcylation）水平的影响。采用O-Glc NAcylation抑制剂BADGP处理或sh RNA干扰技术敲低O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（OGT）表达进行干预,比较干预组和对照组LRP1敲低肝癌细胞整体O-Glc NAcylation表达差异、细胞克隆形成、细胞增殖、细胞迁移和侵袭能力、细胞凋亡的差异。并采用Western Blot进一步比较不同组肝癌细胞中增殖和凋亡相关蛋白表达的差异。4.LRP1调控肝癌细胞整体O-Glc NAcylation水平的机制研究。通过Western Blot和Real-time PCR观察调控O-Glc NAcylation的关键蛋白和基因表达差异。通过临床肝癌和癌旁组织样本观察O-Glc NAcylation表达差异和关键调控蛋白表达差异,即O-连接的N-乙酰葡糖胺水解酶（OGA）、OGT、p-GFPT1蛋白表达差异;免疫组化验证临床肝癌和癌旁组织样本O-Glc NAcylation表达差异和OGA蛋白表达差异。分析LRP1与O-Glc NAcylation表达相关系;分析LRP1与OGA表达相关系。通过免疫共沉淀实验观察LRP1对OGA泛素化水平的影响。通过蛋白质稳定性实验观察LRP1对OGA蛋白稳定性的影响。使用泛素-蛋白降解抑制剂（MG132）处理细胞,观察MG132对LRP1敲低肝癌细胞整体O-Glc NAcylation表达的影响。通过免疫共沉淀观察MG132对LRP1敲低肝癌细胞OGA泛素化水平的影响。使用Western Blot实验技术观察MG132对LRP1敲低肝癌细胞增殖和凋亡相关蛋白的差异表达。5.LRP1β链对肝癌细胞生长和凋亡的影响。通过γ-分泌酶（DAPT）处理细胞,阻断LRP1的C末端片段（LRP1-CTF）剪切生成LRP1-ICD,观察LRP1β链缺失对肝癌细胞整体O-Glc NAcylation水平的影响。构建插入野生型LRP1的β链编码c DNA序列的p Lenti-CMV-Flag-LRP1β-Zs Green（Lenti-Flag-LRP1β）慢病毒过表达质粒,p Lenti-CMV-Flag-Zs Green（Lenti-Flag）空载质粒作为对照,使用HEK293T细胞包装慢病毒后转染LRP1敲低肝癌细胞,构建LRP1β稳定过表达细胞株。通过Western Blot观察LRP1的β链过表达对肝癌细胞整体O-Glc NAcylation表达的影响。利用免疫共沉淀观察LRP1β与OGA之间的相互作用;通过蛋白质稳定性实验观察LRP1的β链对OGA蛋白质稳定性的影响。进一步观察LRP1的β链过表达对肝癌细胞生长和凋亡、增殖、迁移和侵袭能力、凋亡的影响。通过Western Blot观察LRP1β链过表达对增殖和凋亡相关基因表达的影响。最后通过小鼠皮下成瘤实验验证LRP1β链过表达对肝癌细胞皮下移植瘤生长的影响:LRP1敲低肝癌细胞分别感染LRP1β和对照GFP慢病毒,使用嘌呤霉素筛选细胞构建稳定细胞株后,移植到BALB/c小鼠皮下,观察21天后,分析LRP1β对小鼠肝癌增长速度和大小差异。最后通过Western Blot检测LRP1β对肝癌整体O-Glc NAcylation、OGA、凋亡相关蛋白的影响,对细胞实验和小鼠实验结果进一步验证。结果:1.通过CPTAC数据库发现10种恶性实体瘤中,有7种LRP1表达呈现下降趋势,包括肝细胞肝癌（P＜0.001）;三个独立GEO数据集证实LRP1 m RNA水平在肝癌组织中明显下调（P＜0.001）,进一步通过GEO数据库分析发现,LRP1表达量与肝癌恶性程度和不良预后呈负相关性;对临床肝癌和癌旁样本进行Western Blot和免疫组化检测,证实LRP1在肝癌组织中表达呈下降趋势。2.通过体内实验证实:LRP1敲低组肝癌细胞皮下移植瘤生长速度和肿瘤体积大小明显高于对照组。通过体外实验:LRP1敲低组显著促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力;流式细胞术发现LRP1敲低组明显抑制肝癌细胞凋亡;Western Blot实验发现LRP1敲低组磷酸化P38（p-P38）的水平显著下降,cleaved-caspase3和Bax的表达明显降低,而抗凋亡蛋白Bcl2的表达明显增高。3.与对照组相比,LRP1敲低组肝癌细胞整体O-Glc NAcylation水平显著升高。BADGP明显抑制LRP1敲低诱导肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的增强,增加LRP1敲低组肝癌细胞凋亡率到对照组水平。此外,BADGP能完全逆转LRP1敲低对p-P38、cleaved-caspase3和Bax表达的抑制及对Bcl2表达的激活作用。4.LRP1敲低组OGA蛋白表达明显下调,而OGT蛋白表达、OGA和OGT的m RNA表达均无明显差异。临床肝癌和癌旁组织检测证实,与癌旁组织相比,肝癌组织整体O-Glc NAcylation水平呈上升趋势,OGA表达呈下降趋势。免疫共沉淀实验和蛋白质稳定性实验发现,LRP1敲低显著增加OGA与泛素蛋白结合,促进OGA泛素降解,从而上调整体O-Glc NAcylation水平。使用MG132处理细胞后,对细胞功能实验进行检测发现,抑制OGA泛素化降解能明显阻断LRP1敲低诱导的肝癌细胞增殖抑制凋亡。Western Blot证实抑制OGA的泛素化降解能恢复LRP1敲低下调的凋亡相关蛋白表达。5.DAPT阻断实验表明,抑制LRP1-ICD的生成显著提高肝癌细胞整体O-Glc NAcylation表达水平;LRP1的β链过表达能抑制LRP1敲低诱导的O-Glc NAcylation水平增强。LRP1的β链过表达能抑制OGA与泛素蛋白结合,抑制OGA泛素化降解,降低整体O-Glc NAcylation水平。另一方面,LRP1的β链过表达能明显抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,同时明显升高肝癌细胞凋亡率。小鼠体内实验证实,LRP1β链过表达,阻断LRP1敲低对肝癌细胞皮下移植瘤增长的促进作用,肿瘤的生长速度和体积大小回到对照组水平;Western Blot发现,LRP1β链过表达能阻断LRP1敲低对凋亡相关蛋白表达的下调作用,与体外实验结果一致。结论:综上,我们发现HCC患者肝癌组织LRP1表达明显降低。敲低肝癌细胞LRP1的表达,能加快OGA的泛素化降解进而上调整体O-Glc NAcylation水平,增强肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进肝癌进展。过表达LRP1的β链能减弱OGA的泛素化降解,下调整体O-Glc NAcylation水平,抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,减缓肝癌进展。本研究将糖脂代谢的重要调控因子LRP1与O-Glc NAcylation稳态调节及HCC的发生联系起来,在发现LRP1与肝癌恶性程度负相关的基础上,首次证实LRP1表达降低,影响OGA的泛素化降解引起整体O-Glc NAcylation水平升高,抑制P38磷酸化激活,进而促进肝癌细胞和抑制凋亡的具体分子机制。基于上述研究结果,我们提出靶向增加肝脏LRP1的β链表达可能成为临床肝癌治疗的新靶点。