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目的： ①在整体水平研究小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)急慢性感染对调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)增殖活化的影响; ②建立添加和去除Treg的T淋巴细胞和 MCMV感染小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblasts,MEF)体外共培养体系,探明Treg在MCMV中发挥的免疫效应及其可能机制; ③研究大蒜新素对巨细胞病毒感染诱导的Treg异常扩增的作用及其可能机制。 方法： ①建立MCMV全身播散型感染小鼠模型:4周龄BABL/c小鼠,腹腔接种(5×103)PFU Smith株病毒,建立全身播散型感染模型。根据蚀斑法检测的主要脏器内病毒滴度,确定本模型急慢性感染期的界定点; ②整体研究:根据大蒜新素成人中效剂量(120mg/d)换算出小鼠用药的一般剂量(25mg/kg·d);120只模型鼠随机分为安慰剂组和大蒜新素治疗组;并设120只同期模拟感染小鼠为对照,随机分为模拟感染对照组和大蒜新素对照组。病毒接种后24h开始药物治疗,腹腔注射大蒜新素后24h记为1d。分别于大蒜新素处理后1d、3d、7d、14d、28d、45d、60d、75d、90d和120d处死小鼠,获得脾细胞待测。采用Western blot法检测脾细胞中特异性转录因子Foxp3的蛋白表达强度;流式细胞术分析CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在脾细胞中所占比率的变化。 ③T淋巴细胞和CD4+CD25+Treg的纯化:从MCMV预感染2个月的BALB/c小鼠体内分离得到脾细胞,尼龙毛柱法纯化T淋巴细胞,流式细胞术验证T淋巴细胞纯度;纯化的T淋巴细胞再经MACS Treg kit磁珠分选获得CD4+CD25+双阳性Treg细胞和已去除了Treg的T淋巴细胞(T cells depletion of Tregs,TdepTreg),流式细胞术验证CD4+CD25+Treg细胞纯度。 ④体外研究MCMV感染对Treg细胞增殖活化的影响:MCMV感染MEFs(记为MEFMCMV,感染复数为1.0)后与含或不含Treg细胞的T淋巴细胞共培养建立添加和去除Treg的细胞培养模型。分别采用Real-time PCR和流式细胞术检测Treg特异性转录因子Foxp3的基因表达强度和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比率,明确有无Treg细胞扩增。 ⑤调节性T细胞对抗病毒细胞免疫的影响:在添加和去除Treg的细胞培养模型中,分别通过流式细胞术分析效应性T细胞亚群Tc1( CD3+CD8+IFN-γ+)、Tc2(CD3+CD8+IL-4+)、Th1(CD3+CD8-IFN-γ+)、Th2(CD3+CD8-IL-4+)比率变化、Western blot和Real-time PCR方法检测Th1/Th2特异性转录因子T-bet/GATA-3基因和蛋白表达强度、双抗体夹心ELISA方法检测细胞培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-4蛋白表达水平、标准蚀斑法检测共培养体系的感染性病毒量来明确Treg细胞对MCMV感染所诱导的抗病毒细胞免疫效应的影响。 ⑥调节性T细胞发挥免疫抑制效应的机制研究:在添加和去除Treg培养体系中,采用双抗体夹心ELISA法检测共培养细胞上清中TGF-β1和IL-10蛋白表达水平。 ⑦ MCMV诱导调节性T细胞扩增的机制研究:MCMV感染MEFs后(感染复数为1.0)与尼龙毛柱纯化的T淋巴细胞共培养建立T淋巴细胞-MEFMCMV共培养体系;分别在共培养前、共培养1d和3d后,采用RT-PCR法和双抗体夹心ELISA法研究MCMV感染对小鼠胚胎成纤维细胞中转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1基因和培养上清中TGF-β1蛋白表达的影响;用单克隆抗体阻断TGF-β1和/或IL-10达3天后,分别采用Western blot法和流式细胞术分析Foxp3蛋白表达和Treg比率的变化以明确TGF-β1和IL-10在MCMV诱导Treg扩增机制中的作用。 ⑧根据添加和去除Treg研究所得结果,选取Treg细胞发挥抑制效应最显著一组观测大蒜新素对Treg的影响:使用MTT法测定小鼠胚胎成纤维细胞对大蒜新素的最大耐受浓度(maximum tolerance concentration, MTC);MTC大蒜新素处理3d后, Real-time PCR法检测T细胞中Foxp3 mRNA表达水平;流式细胞术分析效应性T细胞亚群比率;双抗体夹心ELISA法检测上清中TGF-β1和IL-10蛋白表达水平变化;标准蚀斑法测定MTC大蒜新素对体系中感染性病毒量的影响。 结果： ①在感染28d后,肝、肾、心、肺组织内均不能分离到感染性病毒,因此确定感染后第28天为动物模型急慢性期界定点; ②在体实验发现,MCMV感染小鼠脾细胞中Foxp3蛋白表达与CD4+CD25+Foxp3+Treg比率的动态变化规律相似,均在MCMV急性感染后期逐渐下降,于感染后28d降至最低;进入感染慢性期后,Foxp3蛋白表达和Treg细胞比率呈直线上升趋势,分别在感染后45d和60d显著高于模拟感染对照组水平,并均于120d时增至峰值;大蒜新素对正常小鼠脾细胞中Foxp3蛋白表达和Treg细胞比率均无显著影响;但是在MCMV感染小鼠,大蒜新素却可在感染慢性期显著减少Foxp3蛋白表达强度、降低调节性T细胞比率,表明MCMV在感染慢性期可诱导调节性T细胞异常增殖活化,而大蒜新素可纠正这一免疫紊乱。 ③使用尼龙毛柱法纯化T淋巴细胞,CD3阳性率为(88.16±3.24)％;经磁珠分选得到的CD4+CD25+双阳性细胞比率大于95%,其中95%的双阳性细胞表达Foxp3。 ④在添加和去除Treg细胞模型中,MCMV感染3d后可显著增加T淋巴细胞中Foxp3的基因表达水平和Treg细胞比率,提示MCMV感染在体外同样可以诱导Treg细胞增殖活化。 ⑤添加和去除Treg细胞模型中,不含Treg的T淋巴细胞与MEFMCMV共培养3d后,病毒负荷量显著低于感染对照组(P<0.01);向该体系中添加Treg可增加感染性病毒量,且该效应与Treg比率呈正性相关。TdepTreg与MEFMCMV共培养3d后,体系中各效应性T细胞亚群细胞数目均较非感染对照组显著增加。增加体系中的Treg比率后,共培养体系中Tc1、Tc2和Th1细胞数目均不同程度减少,且该效应与Treg比率呈负相关;而Th2细胞数量仅在Treg比率增至20%时才显著低于TdepTreg-MEFMCMV共培养体系(P<0.05)。Pearson相关分析显示,Treg与Tc1、Tc2和Th1均呈显著负性线性相关,而Th2仅与Treg呈部分负性线性相关。与TdepTreg-MEFMCMV共培养体系比较,添加Treg可显著增加IL-10和TGF-β1的表达,且相关分析表明增加的IL-10和TGF-β1主要是由Treg分泌的。 ⑥在T细胞-MEF细胞模型中,MCMV感染MEF后,培养上清中TGF-β1蛋白表达和MEF中TGF-β1基因表达的变化趋势一致,均随感染时间延长而显著增加,并在感染后第3d分别增至感染前的2倍(P<0.01)和3倍(P<0.01)水平。 ⑦在T细胞-MEF细胞模型中,单独阻断IL-10对Foxp3蛋白表达和Treg比率无影响;而单独阻断TGF-β1却可部分抵消MCMV感染诱导的Foxp3蛋白表达增强和Treg比率增加,联合阻断效应与单独阻断TGF-β1效应相一致,提示在体外MCMV诱导Treg扩增是部分依赖于TGF-β1的。 结论： ①建立全身播散型MCMV感染小鼠模型,动态监测发现,MCMV在进入感染慢性期后出现抑制性T细胞亚群Treg的进行性数量增加和功能活化,推测Treg可能在CMV致慢性化感染机制中发挥重要作用。 ①建立添加和去除Treg的细胞共培养模型,体外模拟MCMV感染细胞的免疫环境,发现MCMV在体外同样可显著诱导Treg扩增;扩增的Treg可能主要通过分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β1等途径抑制各效应性T细胞亚群的分化和功能发挥;由于Treg抑制作用的不均衡性,导致Th1/Th2、Tc1/Tc2平衡失调,从而创造了一个使病毒能够持续存在的有利免疫环境,这可能是CMV逃避宿主免疫、实现持续或慢性感染的又一重要机制。 ② MCMV感染导致宿主细胞(MEF)TGF-β1表达水平升高,可能是其在外周诱导初级Treg形成、实现Treg种群扩增的重要机制之一。 ③除直接杀病毒作用外,大蒜新素在体内外均可显著纠正MCMV感染导致的Treg异常扩增。大蒜新素抑制TGF-β1和IL-10分泌可能在其中发挥作用。大蒜新素通过影响Treg增殖和功能发挥进而增强抗病毒免疫而有利于机体清除CMV病毒,可能是大蒜新素诱导抗CMV免疫的另一重要机制。