【摘 要】
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本论文利用PCR方法从纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis/natto BZ22)基因组DNA中扩增出纳豆激酶基因(NK),将该基因克隆到克隆载体pMD18-T上,获得重组质粒pMD18-T/NK并进行测序,
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本论文利用PCR方法从纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis/natto BZ22)基因组DNA中扩增出纳豆激酶基因(NK),将该基因克隆到克隆载体pMD18-T上,获得重组质粒pMD18-T/NK并进行测序,结果表明:NK基因由831个核苷酸组成,共编码276个氨基酸,其中不含内含子.利用EXPASY tools、PdbWiewer及RasMol2.6对NK核苷酸序列及氨基酸序列进行基因改造,并进行预测分析.共设计突变16个密码子以降低其自由能,预测突变了2个位置的氨基酸,目的是引入一个二硫键增加纳豆激酶的稳定性同时提高纳豆激酶的纤溶活性.将pMD18-T/NK以及表达质粒pPIC9K分别用EcoR I和Not I双酶切,连接获得重组载体pPIC9K/NK,并将其转化至巴斯德毕赤酵母GS115中,获得重组酵母菌Gs115/NK.培养重组酵母菌Gs115/NK,用甲醇诱导使表达产物分泌到胞外.并用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活性.结果表明,纤溶活性良好.对表达培养基的条件进行了优化,确定了重组纳豆激酶酵母菌的最佳甲醇诱导浓度2％,产酶高峰时间为96小时.
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