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结肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一,随着饮食结构的调整、脂肪含量食物摄入的增多,近年来的发病率呈上升趋势。目前结肠癌的治疗方案是以手术切除为主的综合治疗,化学治疗是其重要的辅助治疗手段,但对化疗药物不敏感已愈来愈引起广泛的重视。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil),是一种细胞DNA合成抑制剂,是结肠癌化疗药物中应用最为广泛的一种,但是有关其耐药性的报道在临床上已经较为常见。FADD,全称是Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated death domain protein),于1995年被发现,在Fas介导的死亡受体凋亡通路中起着重要的作用,被认为是一种促凋亡蛋白。将两者联合运用在结肠癌治疗上的研究鲜有报道,因此本研究第一部分拟通过分子克隆方法构建FADD基因的真核表达载体pEGFP-N1-FADD,运用基因转染技术将重组载体转入人结肠癌SW480细胞并获得稳定转染FADD基因的SW480/FADD细胞。第二部分在体外进行5-氟尿嘧啶干预SW480/FADD细胞以及稳定转染空质粒pEGFP-N1 (SW480/neo)组细胞和正常SW480细胞的研究,观察肿瘤细胞的活力变化和凋亡情况,并初步探讨其发生机制。第三部分在前两部分的基础上,通过将SW480/FADD、SW480/neo和SW480等3种人结肠癌细胞注射在裸鼠皮下,建立人结肠癌皮下移植瘤模型,观察FADD基因联合5-氟尿嘧啶对肿瘤的抑制作用。综合整个实验结果,表明FADD基因可以增强5-氟尿嘧啶对人结肠癌SW480细胞的杀伤作用,凋亡的死亡受体通路可能参与其中,为临床上治疗结肠癌找到了一条新的潜在途径。材料和方法1.提取SW480细胞的总RNA,通过RT-PCR方法获取FADD基因全长cDNA,经限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切后与pEGFP-N1连接构建重组载体pEGFP-N1-FADD,并经内切酶酶切及DNA序列分析证明。利用基因转染技术(LipofectamineTM2000)将重组载体转入SW480细胞,由G418筛选出稳定转染细胞株(SW480/FADD和SW480/neo)。倒置荧光显微镜观察稳定转染细胞,RT-PCR和Western blotting方法检测SW480/FADD、SW480/neo和SW480等3种人结肠癌细胞的FADD表达。2.浓度10 mg/L的5-氟尿嘧啶,分别干预0、6、12、18及24 h后,MTT法检测细胞生存率变化。浓度分别为0.1、1和10 mg/L的5-氟尿嘧啶,干预24 h后,MTT法检测细胞生长抑制率变化。浓度10 mg/L的5-氟尿嘧啶干预24 h后,Hoechst33258染色法及流式Annexin V-FITC/PI法检测FADD/SW480、SW480/neo和SW480等3细胞凋亡情况；Western blotting方法检测procaspase-8和procaspase-3及其激活片段cleaved caspase-8和cleaved caspase-3的表达水平的变化。3.将SW480. SW480/neo和SW480/FADD等3种细胞(5×106,重悬于100μLPBS溶液中)分别接种于裸鼠右侧背部皮下。当肿瘤体积达100-150 mm3后,5-氟尿嘧啶(40 mg／kg)每隔4 d行腹腔内注射,并用游标卡尺测量瘤体长径和宽径,接种后44 d处死裸鼠。观察裸鼠状态和移植瘤的生长状况,绘制生长曲线；称量瘤重；组织病理学观察瘤体形态结构变化；TUNEL方法检测细胞凋亡情况。结果1.在人结肠癌SW480细胞中用PCR法扩增得到FADD基因全长cDNA片段,约651bp大小。重组质粒pEGFP-N1-FADD经过双酶切(得到约4.7 kb和651bp的片段)和DNA测序(结果与GeneBank上公布的序列相一致)表明FADD真核表达载体pEGFP-Nl-FADD构建成功。第14天,经倒置荧光显微镜观测,SW480/FADD和SW480/neo细胞出现肉眼可辨的抗性单克隆。RT-PCR和Western blotting方法检测证实SW480/FADD组的FADD mRNA和蛋白表达与SW480组和SW480/neo组相比明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。而SW480组和SW480/neo组其FADD表达没有差异(P>0.05)。2.不同浓度(0.1、1和10 mg／L)的5-氟尿嘧啶干预SW480/FADD、SW480/neo和SW480细胞24 h后,细胞生长抑制率呈剂量依赖性增高。5-氟尿嘧啶对SW480/FADD细胞抑制率要明显高于SW480和SW480/neo细胞,差异有统计学意义(P<0.05),SW480和SW480/neo两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。浓度为10 mg/L的5-氟尿嘧啶干预0、6、12、18及24 h,SW480、SW480/neo和SW480/ FADD细胞存活数量呈时间依赖性减少。作用24 h后,3种细胞生存率分别为(77.76±9.10)%、(71.71±8.41)%及(43.34±6.45)%,SW480组和SW480/FADD组或者SW480/neo组和SW480/FADD组细胞存活数量之间有统计学差异(P<0.05),SW480组和SW480/neo组细胞存活数量之间无统计学差异(P>0.05)。Hoechst33258染色法结果表明,SW480/FADD细胞比SW480和SW480/neo细胞有更高的凋亡率,差异有统计学意义(P＜0.05),而SW480和SW480/neo细胞之间凋亡率没有差异(P>0.05)。流式Annexin V-FITC/PI法结果显示SW480/FADD细胞凋亡率(33.3±4.5)%,与SW480细胞(13.9±3.2)%和SW480/neo细胞(14.1±3.4)%相比,差异有统计学意义(P<0.05),而SW480和SW480/neo细胞之间凋亡率没有差异(P＞0.05)。以上结果表明过表达FADD基因可以增加5-氟尿嘧啶杀伤人结肠癌细胞的作用。Western blotting法检测结果表明,SW480/FADD细胞,与SW480和SW480/neo细胞相比,cleaved caspase-8和cleaved caspase-3表达增强,而procaspase-8和procaspase-3表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),而SW480和SW480/neo细胞其表达没有差异(P>0.05)。以上结果表明死亡受体通路可能参与了过表达FADD基因增强5-氟尿嘧啶诱导SW480细胞凋亡的过程。3.5-氟尿嘧啶干预后,与SW480和SW480/neo细胞比较,SW480/FADD细胞皮下移植瘤生长速度较慢、体积较小,差异有统计学意义(P<0.05)。组织病理学显示,SW480和SW480/neo细胞数量较多、排列比较紧密、核大浓染、核分裂相较多见；SW480/FADD细胞排列比较松散,更多的细胞出现变性坏死,部分细胞染色体边集并出现凋亡小体。瘤体TUNEL检测结果显示,SW480和SW480/neo细胞,棕黄色核较少,而SW480/FADD细胞棕黄色核较多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论pEGFP-N1-FADD真核表达载体构建成功,并经抗生素筛G418选获得了稳定转染FADD的细胞株,为下一步实验奠定了基础。在体外实验中,过表达FADD基因增加了5-氟尿嘧啶杀伤人结肠癌SW480细胞的作用,凋亡死亡受体通路可能参与了此过程。在体内实验中,FADD基因联合5-氟尿嘧啶比单独5-氟尿嘧啶可以更有效的以凋亡方式抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长。基于以上研究结果,我们为临床上治疗结肠癌找到了一条新的潜在途径。