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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见于中老年的神经退行性疾病,其病理学特征是中脑黑质致密带多巴胺能神经元缺失。黑质铁沉积可能参与PD多巴胺能神经元的损伤过程。我们在前期的研究中发现,星形胶质细胞铁代谢在PD动物模型的黑质铁聚集中发挥重要作用。在星形胶质细胞,铁主要通过二价金属离子转入蛋白1（divalent metal transporter-1,DMT1）转入细胞,进入细胞的铁贮存于铁蛋白中或者经过铁转出蛋白1（ferroportin1,FPN1）转出细胞。铁蛋白有两种亚基,分别是轻链铁蛋白（lightchainferritin,L-Ferritin）和重链铁蛋白（heavy chain ferritin,H-Ferritin）,其表达水平可用于评估细胞内的铁含量。铁调节蛋白（iron regulatory proteins,IRPs）与缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors,HIFs）参与对铁转运蛋白的调控。PD发病中有星形胶质细胞的活化增生。星形胶质细胞的活化导致反应性胶质增生,生成反应性星形胶质细胞,分为A1型与A2型。研究表明,在中枢神经系统炎症中,小胶质细胞通过分泌的前炎性因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α,TNFα）、白细胞介素-1α（interleukin-1α,IL-1α）和补体成分 1q（complement component 1q,C1q）单独和联合作用均可将星形胶质细胞激活为A1型,A1型星形胶质细胞对神经元和少突胶质细胞均有损伤作用,补体成分3（complement component 3,C3）和鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 2（guanine nucleotide binding protein 2,GBP2）可作为A1型反应性星形胶质细胞的特征标志物。而在大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occusion,MCAO）制备的缺血再灌注模型中,星形胶质细胞被激活为A2型,A2型星形胶质细胞具有神经保护作用,五聚蛋白 3（pentraxin-3,PTX3）和 S100 钙结合蛋白 A10（S100 calcium-bindingprotein A10,S100a10）可作为A2型反应性星形胶质细胞的特征标志物。然而两种不同反应性星形胶质细胞铁代谢的变化尚未见报道。目的:观察两种不同反应性星形胶质细胞铁转入蛋白DMT1和铁转出蛋白FPN1表达的变化,从而揭示A1和A2反应性星形胶质细胞铁代谢的异同及其相关机制。方法:本实验采用外源性TNFα处理原代培养的星形胶质细胞以制备A1型星形胶质细胞;采用氧葡萄糖剥夺/复氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型在体外模拟缺血再灌注过程,以制备A2型星形胶质细胞;应用CCK8观察TNFα对原代培养的星形胶质细胞细胞活力的影响;应用实时荧光定量PCR检测原代培养的星形胶质细胞表型标记物mRNA表达水平;采用Western blot检测原代培养的星形胶质细胞铁代谢相关蛋白表达水平。结果:一、TNFα对星形胶质细胞铁代谢的调控机制1.采用 5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、60 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL TNFα处理原代培养的星形胶质细胞24 h,结果显示TNFα浓度不高于60 ng/mL时,TNFα处理组与对照组相比的细胞存活率没有明显变化。因此选定40 ng/mL为后续实验中使用的浓度。2.TNFα处理原代培养的星形胶质细胞24h后,与正常对照组相比,C3 mRNA表达显著升高（P＜0.001,n=6）,GBP2 mRNA 表达显著升高（P＜0.001,n=6）,PTX3 mRNA表达显著降低（P＜0.01,n=6）,S100a10 mRNA表达显著降低（P＜0.01,n=6）。结果表明,TNFα处理后,星形胶质细胞被激活为A1型。3.TNFα处理原代培养的星形胶质细胞24 h后,与对照组相比,HIF-1α蛋白表达无明显变化,HIF-2α蛋白表达显著升高（P＜0.01,n=6）,IRP1蛋白表达显著升高（P＜0.001,n=6）,DMT1 蛋白表达显著升高（P＜0.01,n=6）,FPN1 蛋白表达显著升高（P＜.001,n=6）,H-Ferritin蛋白表达无明显变化,L-Ferritin蛋白表达无明显变化。结果表明,TNFα处理后,星形胶质细胞铁转入蛋白和铁转出蛋白增加,铁转运速率增加,细胞内铁含量无明显变化。4.HIF-2α抑制剂预处理24 h后,与TNFα共孵育原代培养的星形胶质细胞24 h。HIF-2α的表达在TNFα处理后显著上升（P＜0.01,n=6）,HIF-2α抑制剂预处理后,TNFα对其上调被抑制（P＜0.01,n=6）。IRP1的表达在TNFα处理后显著上升（P＜0.01,n=6）,HIF-2α抑制剂预处理后,TNFα对其上调不被抑制。DMT1蛋白表达在TNFα处理后显著上升（P＜0.05,n=6）,HIF-2α抑制剂预处理后,TNFα对其上调被抑制（P＜0.05,n=6）。FPN1蛋白表达在TNFα处理后显著上升（P＜0.001,n=6）,HIF-2α抑制剂预处理后,TNFα对其上调被抑制（P＜.001,n=6）。H-Ferritin和L-Ferritin蛋白表达在TNFα处理后无明显改变,HIF-2α抑制剂预处理后,H-Ferritin和L-Ferritin蛋白表达上调（P＜0.001,n=6）。5.PKCδ抑制剂Rottlerin预处理24h后,与TNFα共孵育原代培养的星形胶质细胞24 h。HIF-2α的蛋白表达在TNFα处理后上升（P＜0.001,n=6）,抑制PKCδ后,TNFα对其上调被抑制（P＜0.001,n=6）。IRP1的蛋白表达在TNFα处理后上升（P＜0.01,n=6）,抑制PKCδ后,TNFα对其上调被抑制（P＜0.05,n=6）。DMT1的表达在TNFα处理后上升（P＜0.001,n=6）,抑制PKCδ后,TNFα对其上调被抑制（P＜0.01,n=6）。FPN1的表达在TNFα处理后上升（P＜0.01,n=6）,抑制 PKCδ 后,TNFα 对其上调被抑制（P＜0.01,n=6）。H-Ferritin的表达在TNFα处理后无明显变化,抑制PKCδ后,其表达上升（P＜0.001,n=6）。L-Ferritin的表达在TNFα处理后无明显变化,抑制PKCδ后,其表达无显著改变。6.HIF-2α抑制剂预处理24 h后,与TNFα共孵育原代培养的星形胶质细胞24 h,与对照组相比,C3 mRNA表达显著升高（P＜0.001,n=6）,S100a10 mRNA表达显著降低（P＜0.01,n=6）。PKCδ抑制剂Rottlerin预处理24h后,与TNFα共孵育原代培养的星形胶质细胞24 h,与对照组相比,C3 mRNA表达显著升高（P＜0.001,n=6）,S100a10 mRNA 表达显著降低（P＜0.01,n=6）。结果表明,抑制HIF-2α或PKCδ并不能阻止TNFα将星形胶质细胞激活为A1型。二、OGD/R处理对星形胶质细胞铁代谢的调控机制1.OGD处理原代培养的星形胶质细胞3h后,分别复氧处理3 h、6 h和12 h,测定细胞C3和PTX3 mRNA的表达。结果显示,仅当在复氧处理6h后,同时观察到细胞C3 mRNA表达水平明显降低（P＜0.001,n=6）,PTX3 mRNA表达水平明显升高（P＜0.01,n=6）。因此选定OGD3h后复氧处理6h为后续实验中OGD/R处理方案。2.OGD/R处理原代培养的星形胶质细胞后,OGD/R组与对照组相比,C3 mRNA表达显著降低（P＜0.01,n=6）,GBP2 mRNA表达显著降低（P＜0.001,n=6）。S100a10 mRNA表达显著升高（P＜0.05,n=6）,PTX3 mRNA表达显著升高（P＜0.001,n=6）。结果表明,OGD/R处理能将星形胶质细胞激活为A2型。3.OGD/R处理原代培养的星形胶质细胞后,OGD/R组与对照组相比,HIF-1α蛋白表达显著降低（P＜0.001,n=6）,HIF-2α蛋白表达无明显变化,IRP1蛋白表达无明显变化,DMT1蛋白表达无明显变化,FPN1蛋白表达无明显变化,H-Ferritin蛋白表达无明显变化,L-Ferritin蛋白表达无明显变化。结果表明,0GD/R处理后,星形胶质细胞的铁代谢无明显变化。结论:上述结果表明,TNFα能将原代培养的星形胶质细胞激活成A1型,A1型星形胶质细胞DMT1和FPN1表达增加,铁转运速率增加,细胞内铁含量无明显变化。TNFα引起原代培养的星形胶质细胞DMT1与FPN1的变化可能与HIF-2α的上调有关,而HIF-2α的上调可能是PKCδ的激活所致。A1型星形胶质细胞铁转运速率的增加将可能导致临近神经元的铁沉积,从而损伤神经元。0GD/R能将原代培养的星形胶质细胞激活成A2型,但A2型星形胶质细胞DMT1和FPN1的表达不变,铁转运能力无明显改变,可能与神经元铁沉积损伤无关。因此,星形胶质细胞铁代谢的变化与星形胶质细胞不同的激活表型有关,A1和A2两种反应性星形胶质细胞铁代谢的变化不同,这与它们的神经毒性和神经保护性功能相关。A2型星形胶质细胞铁转运能力不发生改变,本研究为进一步探讨PD黑质铁聚集的机制提供了一定的理论和实验依据。