研究背景与目的结直肠癌(Colorectal carcinoma,CRC)是一种源自结肠或直肠的胃肠道恶性肿瘤,它在女性中是第二大常见肿瘤,在男性中是第三大常见肿瘤,严重威胁着人类的生命健康。尽管通过一定的筛查方法已相对减少CRC相关的死亡,但是缺乏更早、更有效的诊断方法,并且进展期和中晚期CRC患者的五年生存率仍然很低。因此,深入研究CRC发生发展的分子机制,寻求更加有效的预防和诊治方法以进一步提高对CRC的防治水平,已成为全球医疗卫生体系亟需解决的重要科学问题。CRC的病因及发病机制十分复杂,遗传和环境的变化都有可能影响疾病进程。微生物检测技术的进步和人体微生物组学研究为CRC的发病机理和发展进程提供了新的视角。越来越多的文献报道显示,肠道菌群的失调与多种肠道疾病,包括炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)和大肠肿瘤(如CRC)之间存在明显的相关性。近些年来,研究发现,一种在口腔炎性疾病中较常见的革兰阴性厌氧菌具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)与CRC的发生、转移、复发和生存率密切相关;一项来自北美的研究结果提示,Fn的检测在CRC患者的诊断和预后的判断上都具有很大的潜在价值,并建议将Fn作为疾病从腺瘤发展为癌症的新危险因素。但是,Fn促进CRC进展的具体分子机制均待阐明。肿瘤的炎性微环境对其进展至关重要。巨噬细胞(macrophage,Mφ)是血液中的单核细胞浸润到肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)并分化而来的,是TME中的一种重要的免疫细胞,在炎症和肿瘤之间起着关键的纽带作用。在TME中多种成分的刺激下,Mφ的表型和功能会发生不同的变化,分化为促炎症、抗肿瘤的M1-Mφ或促肿瘤、抗炎症的M2-Mφ。据报道,M2-Mφ促进CRC的生长和转移进程,并且与CRC患者的高复发率明显相关。已有研究发现,Fn可通过促进TME中炎性相关因子的分泌而形成有利于Mφ浸润的炎性微环境,进一步介导CRC的进展。然而,在Fn相关CRC的TME(Fn-CRC-TME)中,参与促进Mφ表型极化的细胞因子以及其具体的分子机制都尚未完全阐明。炎性分子S100A9属于S100家族中的一员,在多种类型的细胞中表达,尤以髓系细胞为主,故又称为髓系相关蛋白。已知S100A9在炎症反应中发挥关键作用,并且在多种肿瘤中呈高表达。在CRC患者的血清和病变组织中,S100A9水平明显升高,并且与CRC的临床分期和远处转移密切相关。课题组前期研究发现,S100A9可直接促进CRC细胞的增殖及迁移,并且可调控髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs),发挥肿瘤免疫抑制作用,进一步促进CRC的发展。可见,S100A9分子参与调控CRC患者的免疫反应,并因此影响疾病的进程。但是,具体机制有待阐明。基于此,本课题以Fn、人单核细胞系THP-1和CRC细胞HCT116、SW480为研究对象,探讨Fn对Mφ极化的影响和机制、Fn对CRC细胞增殖和迁移的直接作用和机制以及Fn通过Mφ对CRC细胞增殖及迁移产生的间接影响及其潜在的分子机制,探究并阐明S100A9是否参与其中。旨在为阐明Fn-CRC-TME中Fn、S100A9、Mφ和CRC细胞之间复杂的相互作用以及其对CRC进展的影响和机制积累实验依据,同时也为CRC的预防和临床诊断、治疗提供新策略。方法1 Fn对Mφ极化的作用及机制1.1重组蛋白GST-human S100A9(简称rS100A9)和GST蛋白的制备与鉴定。1.2Fn对Mφ极化的影响1)本研究检测的M1型标志基因包括iNOS和TNF-a,M2型标志基因包括IL-10和CD206,M1和M2型相关蛋白质分别是CD86和CD206。它们通称为M1和M2型的标志分子;2)Fn处理Mφ:24h后用qPCR、48 h后用Western blot、免疫荧光试验和流式细胞术分别检测M1和M2型的标志分子的变化;1.3 S100A9在Fn促Mφ极化中的作用1)qPCR、Western blot和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测Fn处理Mφ和CRC细胞后,两种细胞中S100A9 mRNA和蛋白水平的变化;2)转染S100A9小片段干扰RNA(siS100A9)到Mφ 6 h后,再经Fn处理,24 h后用qPCR、48 h后用Western blot、免疫荧光试验分别检测M1和M2型标志分子的变化;3)转染siS100A9到CRC细胞6 h后,再经Fn处理48 h,收集上清液并制备成条件培养基[简称:(CRC+siS100A9+Fn)-CM]备用;用该CM处理Mφ后,qPCR和Western blot分别检测M1和M2型标志分子的变化;4)rS100A9 处理 Mφ 后,qPCR 和 Western blot 分别检测 M1 和M2型标志分子的变化;1.4 Fn-CRC-TME中的Fn影响Mφ和CRC细胞S100A9表达及Mφ极化的分子机制1)Fn处理Mφ和CRC细胞24 h后,qPCR检测TLR4 mRNA水平的变化;2)Fn处理Mφ和CRC细胞后,于不同时间点收集细胞,Western blot检测p-p65蛋白质水平的变化;3)TLR4信号通路抑制剂TAK-242预处理细胞60 min后,再加入Fn处理2 h,Western blot检测p-p65蛋白质水平的变化;4)TAK-242 或 Bay 11-7082 预处理 Mφ 和 CRC 细胞 60 min,再经Fn处理48 h,Western blot和ELISA检测细胞中S100A9的表达水平;5)TAK-242 或 Bay 11-7082 预处理 Mφ 60min,再经Fn处理 24 h,qPCR检测M1和M2型标志分子的mRNA水平变化;6)TAK-242或Bay 11-7082预处理CRC细胞60min,再经Fn处理48 h后收集上清液制备CM,用该CM处理Mφ 24 h,qPCR检测M1和M2型标志分子的mRNA水平变化;1.5 CRC患者肿瘤组织中Fn的富集程度与Mφ表型、S100A9表达的关系1)原位杂交(Fuorescencein situ hybridization,FISH)检测 CRC患者组织切片中的Fn,判断Fn(-)和Fn(+)的标本;2)免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测Fn(-)和 Fn(+)标本中Mφ标志分子CD68、M1型标志分子CD86和M2型标志分子CD206以及Fn-CRC-TME中S100A9的表达,判断Fn的富集程度与Mφ表型、S100A9的关系;2.Fn对CRC进程的直接和间接作用及机制2.1 Fn对CRC细胞增殖及迁移的直接作用及机制1)本研究中采用CCK8和Transwell试验分别检测CRC细胞的增殖和迁移能力;2)Fn处理CRC细胞后,检测其增殖及迁移能力的变化;3)转染siS100A9到CRC细胞6 h再经Fn处理后,检测其增殖及迁移能力的变化;2.2 Fn通过Mφ对CRC细胞增殖及迁移的间接作用及机制1)Fn的间接作用:Fn处理Mφ 48 h后,收集上清液制备成CM[(Mφ+Fn)-CM],用该CM孵育CRC细胞,再检测其增殖及迁移能力的变化;2)机制探讨:(1)抑制Fn的促Mφ极化作用对该间接作用的影响:转染siS100A9到Mφ 6 h、再经Fn处理48 h后,收集上清液制备成CM[(Mφ+siS100A9+Fn)-CM],用该CM孵育CRC细胞后,分别检测其增殖及迁移能力的变化;(2)M2-Mφ对CRC的作用:加入外源性rS100A9诱导Mφ 24 h(使之极化),更换为新的培养基继续培养48 h,收集上清液制备成CM[(Mφ+rS100A9)-CM],用该CM孵育CRC细胞后,分别检测其增殖及迁移能力的变化;2.3 Fn处理后的Mφ对小鼠皮下肿瘤生长的影响通过将Mφ与CRC共注射到小鼠皮下构建小鼠皮下移植瘤模型,以验证Fn经由Mφ介导的间接作用。按照Mφ所受的不同处理进行如下分组:Control E.coli组、Fn组、(Fn+siNC)组和(Fn+siS100A9)组。观察小鼠肿瘤生长,每三天使用游标卡尺检测肿瘤的长度和宽度。根据以下公式计算肿瘤体积:体积=(宽度)2×长度/2。21天后处死小鼠,取出肿瘤组织逐一称重并切下部分组织提取总蛋白以进行Western blot分析;剩余的组织用4%的甲醛缓冲液固定后进行石蜡包埋,随后切片和进行IHC分析。IHC和Western blot检测各组小鼠肿瘤组织中增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)、EMT 相关蛋白 E-cadherin 和 N-cadherin。结果1.Fn对Mφ极化的作用及机制1.1成功制备并鉴定实验所需重组蛋白rS100A9和GST蛋白。1.2 Fn促进Mφ向M2型极化Fn处理的Mφ中:1)M1型标志基因iNOS、TNF-a mRNA水平降低(P<0.05或0.01),M2型标志基因IL-10、CD206 mRNA水平升高(P<0.05或0.01);2)CD86的蛋白质水平降低,CD206的蛋白质水平升高。提示,Fn促进Mφ向M2型极化,即形成M2-Mφ。1.3 Fn-CRC-TME中的S100A9参与介导Fn的促Mφ向M2型极化的作用1)Fn处理的Mφ和CRC细胞中S100A9 mRNA和蛋白质水平均高于相应的对照组(P<0.05或0.01),其培养上清中S100A9的含量也均高于对照组(P<0.05或0.01)。提示Fn可上调TME中Mφ和CRC细胞S100A9的表达和分泌。2)Mφ中的S100A9参与介导Fn促Mφ向M2极化的作用。实验结果:(Fn+siS100A9)组的M1型标志基因iNOS、TNF-a的mRNA水平和CD86蛋白质水平高于对照组(P<0.05),而其M2型标志基因IL-10、CD206的mRNA水平和CD206蛋白质水平低于对照组(P<0.05或0.001)。即在干扰Mφ中S100A9表达后,Fn诱导的M1型标志物下调和M2型标志物上调的作用被逆转,即抑制了 Fn诱导的Mφ向M2型极化。3)用(CRC+siS100A9+Fn)-CM孵育Mφ,也可抑制Fn诱导的Mφ向M2型极化。实验结果:(1)与对照组(CRC+siNC+Fn)相比,(CRC+siS100A9+Fn)组上清液中S100A9的水平明显降低(P<0.01);(2)用该上清液制备的CM孵育的Mφ中M1型标志基因iNOS、TNF-a的mRNA水平高于对照组(P<0.05),M2型标志基因IL-10、CD206的mRNA水平低于对照组(P<0.05或0.01);与上述变化一致的是CD86的蛋白质水平升高,而CD206的蛋白质水平降低。再次提示Fn-CRC-TME中的S100A9参与介导Fn诱导的Mφ向M2型极化。4)rS100A9 处理 Mφ 后,M1 型标志基因 iNOS、TNF-a mRNA 水平降低(P均<0.05),M2型标志基因IL-10、CD206 mRNA水平升高(P均<0.05);同时,Mφ中CD86蛋白质水平降低,CD206蛋白质水平升高。进一步证明微环境中的S100A9具有促进Mφ向M2型极化的作用。本部分(1.3)结果一致提示,在Fn-CRC-TME中S100A9的水平对Fn诱导的Mφ向M2型极化起着关键性的作用。1.4 Fn通过TLR4/NF-κ B信号通路上调TME中Mφ和CRC细胞S100A9的表达和分泌,进而促进Mφ向M2型极化1)Fn处理的Mφ和CRC细胞中TLR4的mRNA水平高于对照组(P均<0.01),p-p65的蛋白质水平逐渐增加且呈时间依赖性;但是,当加入TLR4信号通路抑制剂TAK-242预处理细胞60 min,Fn上调细胞中p-p65的作用被显著抑制。提示Fn激活了 Mφ和CRC细胞中TLR4/NF-κ B信号通路。2)TAK-242 或 Bay 11-7082 预处理 Mφ 和 CRC 细胞 60 min 后,Fn上调S100A9的作用也被显著抑制,提示Fn上调Mφ和CRC细胞中S100A9表达的机制涉及TLR4/NF-κ B信号通路的激活。3)TAK-242 或 Bay 11-7082 预处理 Mφ 60 min 后,Fn诱导的 Mφ向M2型极化的作用被明显抑制,表现为:M1型标志基因iNOS、TNF-a的mRNA水平高于对照组(P<0.05),M2型标志基因IL-10、CD206的mRNA水平低于对照组(P<0.05或0.01)。上述结果提示,Fn促进Mφ向M2型极化,其机制涉及Mφ中TLR4/NF-κ B/S100A9信号通路的激活。4)TAK-242 或 Bay 11-7082 预处理 CRC 细胞 60 min 后,再用 Fn处理,用其上清液制备的CM[(Fn+TAK-242+CRC)-CM或(Fn+BAY 11-7082+CRC)-CM]孵育的 Mφ 中 M1 型标志基因iNOS、TNF-a mRNA水平的下调(P<0.05或0.01)和M2型标志基因IL-10、CD206 mRNA水平的上调被明显抑制(P<0.05或0.01),即CRC细胞中TLR4/NF-κ B/S100A9信号通路的激活是Mφ向M2型极化的重要机制。本部分(1.4)结果提示,Fn-CRC-TME中来自CRC和Mφ的S100A9是Fn促Mφ向M2型极化的关键因子,其中Fn上调S100A9表达的机制涉及TLR4/NF-κ B信号通路。1.5 CRC患者肿瘤组织中Fn的富集程度与M2-Mφ表型、S100A9表达呈正相关一个镜视野中Fn数小于5的记为Fn(-),5～20记为Fn弱(+),大于20的记为Fn(+)阳性。与Fn(-)的组织相比较,Fn(+)的组织中S100A9的表达较高,并且有更多的Mφ浸润,且大多数为M2-Mφ。这些结果提示在CRC中,Fn的富集程度与M2-Mφ表型和S100A9存在正相关。该临床标本的研究结果与前述实验结果相符合,综合分析可知:Fn通过激活Mφ和CRC细胞中TLR4/NF-κ B信号通路促进S100A9的表达和分泌,引起微环境中的S100A9增加;Fn-CRC-TME中上调的S100A9参与介导Fn促Mφ向M2型极化的作用。2.Fn对CRC进程的直接和间接作用及机制2.1 Fn直接促进CRC细胞的增殖及迁移,其机制涉及S100A9的上调Fn处理后的HC116和SW480细胞在24 h和48 h的增殖能力及24 h的迁移能力明显增强(P<0.001或0.01);但是,干扰CRC细胞中S100A9表达后,Fn促CRC细胞增殖及迁移的作用被明显抑制(P均<0.001)。提示S100A9参与介导Fn促进CRC细胞增殖及迁移的作用。2.2 Fn经由Mφ间接促进CRC细胞增殖、迁移和肿瘤的生长,其机制涉及M2-Mφ的诱导形成1)与对照组相比,(Mφ+Fn)-CM组中HCT116和SW480细胞在24 h和48 h的增殖能力均明显增强(P均<0.001),但是在阻断Fn促Mφ极化作用的(Mφ+siS100A9+Fn)-CM组中,两种细胞在这两个时间点的增殖能力均明显低于相应的(Mφ+siNC+Fn)-CM对照组(P<0.05、0.01或0.001)。同时,Fn组中小鼠皮下肿瘤的体积和重量明显大于Control E.coli对照组(P<0.001),瘤组织中PCNA的蛋白质水平也较高;而(Fn+siS100A9)组肿瘤体积和重量则明显小于(Fn+siNC)对照组(P<0.001),瘤组织中PCNA的蛋白质水平也明显低于(Fn+siNC)组。上述体外和体内实验结果一致,均提示Fn具有Mφ介导的间接促CRC细胞增殖的作用,其机制与Fn诱导Mφ向M2型极化相关。2)与对照组相比,(Mφ+Fn)-CM组中HCT116和SW480细胞在24h的迁移能力明显增强(P均<0.001),但是(Mφ+siS100A9+Fn)-CM组中细胞的迁移能力均明显低于(Mφ+siNC+Fn)-CM对照组(P均<0.001)。Western blot和IHC检测皮下移植瘤组织时发现,Fn组的EMT相关蛋白E-cadherin低于对照组,而N-cadherin高于对照组;但是,在(Fn+siS100A9)组上述蛋白质的水平则相反。综上,体外与体内的结果一致提示,Fn具有Mφ介导的间接促CRC细胞迁移和EMT的作用,其机制与Fn诱导Mφ的M2型极化相关。3)M2-Mφ促进CRC细胞的增殖和迁移:用rS100A9诱导Mφ向M2型极化。[(Mφ+rS100A9)-CM]组中HCT116和SW480细胞的增殖和迁移能力均大于(Mφ+GST)-CM对照组(P均<0.001)。结合第一部分结论(Fn促Mφ向M2型极化),本部分(2.2)的结果证明Fn可经由Mφ介导其间接促进CRC细胞增殖及迁移的作用,机制涉及M2-Mφ的诱导形成。结论1.Fn可上调Fn-CRC-TME中Mφ和CRC细胞中S100A9的表达,其机制均涉及TLR4/NF-κ B信号通路的激活。2.Fn促进Mφ向M2型极化,其机制涉及TLR4/NF-κ B/S100A9信号通路的激活。3.Fn直接促进CRC细胞增殖及迁移,其机制与Fn上调CRC细胞中S100A9的表达有关。4.Fn具有经由Mφ介导的间接促进CRC细胞增殖、迁移和肿瘤的生长的作用,其机制涉及M2-Mφ的形成。