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基因打靶技术是20世纪80年代后半期兴起的一种对生物遗传信息精细改造的生物技术手段,本研究应用基因打靶技术构建Edar基因敲除绒山羊胎儿成纤维细胞系。毛囊的周期性变化是多基因参与并紧密联系和相互制约的复杂生理生化过程。绒山羊皮肤中的毛囊分为初级毛囊和次级毛囊,其中初级毛囊发育形成羊毛,而次级毛囊发育形成羊绒。其中Edar基因编码初级毛囊发育过程中的一个信号受体分子,Edar基因属于肿瘤坏死因子超家族成员,目前只发现该基因与外胚层汗腺、毛发、羽毛、及牙齿等发育有关。本研究通过应用Cre-LoxP重组系统来对绒山羊胎儿成纤维细胞的Edar基因敲除,探讨Edar基因对绒山羊毛囊发育的影响。正确克隆了角蛋白14启动子(K14),分别构建了由K14启动子和CMV启动子来启动红荧光蛋白(DsRed)基因的载体；将其转染绒山羊胎儿成纤维细胞、表皮细胞和初级毛乳头细胞,经筛选后分别得到转染pK14-DsRed质粒和pCMV-DsRed质粒的六种阳性细胞；以CMV启动子作为对照通过real-time PCR方法检测K14启动子启动红色荧光蛋白表达的效率,发现K14启动子在山羊初级毛乳头细胞、山羊表皮细胞中启动外源基因的启动效率高于在胎儿成纤维细胞中的启动效率,具有组织特异性。正确克隆了绒山羊Edar基因的部分cDNA序列,并获得了绒山羊Edar基因第12号外显子两翼各近4Kbp的基因组序列。选择合适片段作为打靶载体的同源臂,其中上游同源臂为3058bp,下游同源臂为3765bp。成功构建了pKnock-Edar、pK14-Cre两个打靶载体。以线性化的pKnock-Edar质粒对绒山羊胎儿成纤维细胞进行了转染,通过药物筛选得到了耐药性细胞,并通过单克隆细胞培养方法对耐药性细胞扩大培养。通过PCR方法鉴定出了一个打靶阳性的细胞系,并对其进行pK14-Cre质粒的转染。获得了可用于制备Edar基因敲除个体的细胞系。