头孢菌素C脱乙酰基酯酶(CAH)[EC3.1.1.41]是一种能够催化头孢菌素C(CPC)或7-氨基头孢烷酸(7-ACA)3’位置乙酰基水解的酯酶。CPC或7-ACA脱掉乙酰基后可以作为前体,用于合成各种半合成头孢菌素类抗生素,如头孢氨呋肟、头孢西丁、头孢泊肟酯等。本课题旨在通过对表达质粒、发酵策略的系统优化实现枯草芽孢杆菌来源的CAH在大肠杆菌系统中的高水平表达,并通过固定化条件的优化,获得高活力的固定化CAH制剂。课题构建了 8种诱导型质粒和16种组成型质粒试图实现CAH基因的高效异源表达。经过筛选,最终选择带有pUC19上的起始位点、SIL3基因、Trp启动子以及间隔序列为B1的组成型表达质粒pB1-SIL3-K为最佳表达质粒。将组成型质粒PB1-SIL3-K转化大肠杆菌DH5α,37℃发酵培养24h,其酶活可以达到了 144U/mL。为了提升重组CAH的表达水平,降低生产成本,课题进一步研究了影响发酵的各个因素,对接种种龄、发酵培养基的组成和发酵条件进行了优化。确定摇瓶发酵培养基的最佳组份配比是:2%白糊精,2%安琪酵母粉,2%的鱼骨蛋白胨和1×M9基础盐。优化后,摇瓶发酵CAH的最高酶活单位可达到420U/mL。进一步通过控制pH值和补加4%甘油在7L发酵罐上放大培养,24小时后CAH最高酶活达到1340U/mL,此表达水平为目前国内外文献报道的最高水平。利用氨基载体HA和环氧基载体EP对CAH进行了固定化研究。通过对固定化条件的优化,成功地制备了 CAH的两种固定化酶,其单位酶活均超越目前商品化酶。固定化酶比游离酶拥有更宽的pH稳定范围和温度稳定范围,其最适温度和pH值分别为60-65℃与 8.0-8.5。