【摘 要】
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DLK1-DIO3印记簇位于人类染色体14q32,包含DLK1、RTL1和DIO3这三个父源表达的蛋白质编码基因,和几个大小不一的母源表达的非编码RNA。在这些非编码RNA的基因区间内和内含子中,存
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DLK1-DIO3印记簇位于人类染色体14q32,包含DLK1、RTL1和DIO3这三个父源表达的蛋白质编码基因,和几个大小不一的母源表达的非编码RNA。在这些非编码RNA的基因区间内和内含子中,存在大量的C/DsnoRNAs和microRNAs。父本甲基化的IG-DMR和Gtl2/MEG3-DMR是该印记簇内起主要调控作用的两个差异甲基化区域,先前研究显示这两个DMR区域的亲本特异性敲除会对区间内的基因表达及胚胎发育产生广泛的影响。MEG8-DMR为DLK1-DIO3印记簇内新发现的母本差异甲基化区域,位于MEG8的第二个内含子中。腺病毒载体和SB转座子系统在小鼠Meg8-DMR附近的整合插入效应,导致了上下游基因表达的异常,使小鼠肝癌的发生率增高。这暗示MEG8-DMR可能作为一种重要的DNA调控序列,对上下游基因的表达和原发性肝癌发生存在相应的调控作用。 本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在人源肝癌Huh7细胞系中敲除MEG8-DMR,研究MEG8-DMR对相关基因的表达变化和Huh7细胞生物学行为的影响。我们构建Cas9-MEG8-DMR重组载体并瞬时转染Huh7细胞,结果显示其可在细胞基因组水平有效敲除MEG8-DMR。敲除MEG8-DMR后在mRNA水平上,DLK1、DIO3、IGF2的表达水平下调;MEG3、MEG8的表达水平无明显变化,MEG9的表达水平上调;同样miR-370的表达水平发生上调。MEG8-DMR的敲除使细胞增殖能力和克隆形成能力减弱,并促进了细胞凋亡;细胞形态、细胞迁移侵袭能力、细胞周期并没有发生显著性变化。 综上所述,MEG8-DMR对于相关基因的表达具有调控作用,并以此影响Huh7细胞的生物学行为。这些结果对于进一步探究MEG8-DMR的调控功能和调控机制具有重要意义。
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