背景:丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV),是一种主要入侵肝细胞的的RNA病毒。在病毒学分类上是肝炎属黄病毒家族,HCV的基因组是多顺反子,所有基因位于一条RNA链上,总长约10 Kb,HCV侵入机体后,在宿主和病毒自身一些酶的作用下,基因组编码为一条多聚肽链,然后经一系列的加工切割为结构蛋白(Core,E1和E2)和非结构蛋白(p7,NS2～NS5B)。HCV主要通过血源性感染途径侵袭机体,造成肝炎、肝纤维化甚至转变为肝癌。目前全球约有7000万人感染HCV,其中80%的患者可发展为慢性持续性感染。自然条件下的HCV的免疫原性很低,目前世界上还未研发出有效防治HCV的疫苗。欧美国家已有多种针对HCV的直接抗病毒药物(DAA)如索非布韦(sofosbuvir)、达沙布韦(dasabuvir)等均对HCV感染者有良好的治疗效果。在我国,各级医院针对HCV患者的治疗方案仍然是早期的利巴韦林合并干扰素给药,这种治疗手段价格昂贵,受众少,并有一定副作用。因此研究HCV致病机制,探索新型HCV疫苗对HCV的防治十分必要。目的:HCV编码的结构蛋白Core对HCV病毒基因组RNA具有重要的保护作用。我们实验室前期研究发现HCV coe基因上存在G-四链体结构,该结构是广泛存在于细胞基因组以及RNA中的一种二级结构,它参与基因的表达调控,对该结构的研究有助于揭示HCV长期慢性感染的机制。方法:首先体外合成寡核苷酸链HCV core RNA G4(命名为G4R)及其突变体G4M序列(命名为G4RM),利用圆二色谱(Circulardichroism,CD)检测G4R及其突变体G4RM能否在体外自动形成形成G-四链体空间结构,比较二者稳定性差异;然后利用聚合酶链式扩增技术(PCR)扩增得到1a型的HCV core基因的DNA序列,在不改变密码子的前体下,用“三步PCR点突变”方法将G4-core突变为G4M-core,再将二者构建到真核表达载体pcDNA3.1上(分别命名为pG4和pG4M);最后将pG4和pG4M重组DNA疫苗免疫小鼠,检测二者引起的免疫应答差异。结果:CD结果表明G4R突变为G4RM后,其稳定性下降;蛋白质印迹(Western Blot)证明pG4和pG4M均能在细胞和动物水平有效表达,且pG4M组Core蛋白表达量高于 pG4 组;酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验发现pG4M质粒相较pG4质粒能引起更高水平的总IgG及IgG2a。酶联免疫斑点(Enzyme-linked immunospot,ELISpot)实验结果显示,pG4M免疫后的小鼠脾脏细胞IFN-y的释放水平高于pG4组免疫小鼠。流式实验显示pG4M免疫后的小鼠脾脏DC细胞IL-12的分泌水平高于pG4组,CD4+T细胞中IFN-γ的产生水平高于pG4组免疫小鼠。结论:综上所述,我们研究发现HCV核心抗原core基因上G-四链体碱基突变可以提高core基因在翻译水平的蛋白表达,增强其诱发的Th1型细胞免疫应答。核心抗原core的G-四链体碱基突变可导致其结构不稳定,增强了自身的蛋白表达。本研究结果能够为研发增强免疫原性的HCV疫苗提供一定的视角和策略。