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红枣是陕北地区重要的农业经济产物,近年来由于枣疯病的影响,使得红枣产量急剧下降,对农业经济影响极大。目前对枣疯病的研究甚少,其致病机制尚不清楚,迫切需要研究出一定的手段对枣疯病进行防治。本试验以枣疯病植原体为研究对象,采用高通量测序技术,对患枣疯病枣树根部和枝条的内生细菌群落进行多样性分析,通过16S rDNA测序和平板计数法对枣树内生细菌进行分离与定殖,使用SignalP v.3.0程序和跨膜结构域预测程序TMHMM对枣疯病植原体的效应蛋白进行生物信息学预测,通过反转录技术构建狗头枣组培苗的酵母双杂交cDNA文库,并构建诱饵载体,为下一步酵母双杂交技术在植物体内筛选靶标蛋白打下一定的科学基础,同时为枣疯病植原体致病机制的研究提供数据支撑和理论依据。研究结果如下:1.通过高通量测序技术,对同一患枣疯病枣树根与枝条的内生细菌分别进行群落多样性分析,健康枣树中根与枝条的内生细菌分别作为对照。患枣疯病枣树根中细菌的群落多样性小于健康枣树的根,且常见菌群存在差异;患枣疯病枣树的枝条中细菌的群落多样性大于健康枣树的枝条,且优势菌群与常见菌群存在明显差异,说明枣疯病植原体对枣树根部和枝条的细菌群落具有明显的影响。对同一患枣疯病枣树不同部位的内生细菌进行群落多样性分析,发现患枣疯病枣树的根中细菌的群落多样性大于患枣疯病枣树的枝条,且优势菌群与常见菌群存在差异,说明在患枣疯病枣树中,不同部位的细菌群落多样性不同。2.我们对患枣疯病枣树内生细菌进行了分离与定殖试验,共筛选到21个菌株,其中固氮菌属(Kosakonia)菌株有7个:Kosakonia(X)、Kosakonia(Y)、Kosakonia(N)、Kosakonia(YD)、Kosakonia(GH)、Kosakonia(NB)、Kosakonia(G);假单胞菌属(Pseudomonas)菌株有7个:Pseudomonas(Z)、Pseudomonas(ZH)、Pseudomonas(YX)、Pseudomonas(c2)、Pseudomonas(c1)、Pseudomonas(f1)、Pseudomonas(23);泛菌属(Pantoea)菌株有3个:Pantoea(XD)、Pantoea(NH)、Pantoea(10);肠杆菌属(Enterobacter)菌株有2个:Enterobacter(GB)、Enterobacter(f2);肠球菌属(Enterococcus)菌株有1个:Enterococcus(d1);特布尔西式菌属(Trabuisiella)菌株1个:Trabuisiella(d2)。挑选出其中的11个,通过电激法将pBBR-gfpmut3质粒与pPBBR1MCS-5质粒导入11个菌株中,使其带有荧光蛋白基因,进行内生细菌的定殖研究,结果发现11个菌株中假单胞菌属(ZH)可在狗头枣组培苗中定殖。3.通过植物组织培养技术将患有枣疯病的枣树嫩茎培养成组培苗,通过巢氏PCR检测、测序以及比对,确定我们所培养的组培苗为带有枣疯病植原体的组培苗。4.通过反转录技术构建狗头枣组培苗的酵母双杂交cDNA文库,我们挑选插入片段的单克隆经PCR进行电泳检测:平均插入片段大于1200bp,库容检测结果为:文库库容大于1.15*10~7CFU,由此可见我们所构建的文库合格。我们生物信息学预测出枣疯病植原体的11种效应因子:CWO85-00790、CWO85-00795、CWO85-00800、CWO85-00890、CWO85-01400、CWO85-02040、CWO85-02055、CWO85-02325、CWO85-03070、CWO85-03075、CWO85-03080,同时构建了9种相应的诱饵载体:pGBKT7-00790、pGBKT7-00800、pGBKT7-00890、pGBKT7-03070、pGBKT7-02325、pGBKT7-00795、pGBKT7-01400、pGBKT7-02040、pGBKT7-03080。