核转录因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)诱导表达的基因广泛参与各种生命活动,在免疫应答中起着非常重要的调节作用。NF-κB过度活化可以直接引起组织损伤、自身免疫性疾病以及炎症相关的癌症。因此,NF-κB信号通路的严密调控对维持机体免疫稳态起重要作用。目前,NF-κB活化的负向调节机制尚不完善。我们发现IKIP(IKK-interactingprotein,IKIP)能够通过与NEMO竞争性的结合IKKα/IKKβ抑制IκB激酶(IKB kinase,IKK)复合体的形成,从而阻碍IKKα/β的磷酸化进程并负向调节下游NF-κB信号通路的活化。LPS、poly(I:C)、TNF-α和IL-1β等刺激剂激活信号通路时,Ikip缺陷小鼠巨噬细胞中IKKα/β、IκB和p65的磷酸化更强,TNF-α和IL-6的表达更多;脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的脓毒性休克模型和硫酸葡聚糖钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)诱导的结肠炎模型中,Ikip缺陷小鼠更易感。综上所述,本课题研究揭示了 IKIP在NF-κB信号中的负向调节作用及其机制,丰富了 NF-κB的负向调节机制,并为IKK的激活调控提供了新的分子机制,可能有助于炎症性疾病新治疗策略的发展。研究目的1.明确IKIP在NF-κB活化和炎症反应中的作用。2.探究IKIP在NF-κB信号通路中的作用机制。研究方法1.明确IKIP与IKK复合体的相互作用及其相互作用的结构域。1.1细胞实验明确IKIP与IKK复合体的相互作用;将Myc标签的IKIP1和IKIP2表达质粒分别与HA标签的IKK复合体表达质粒共转染到HEK293T细胞中,24小时后提取细胞蛋白,使用Myc标签抗体做免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP),通过蛋白印迹(western blot,WB)检测IKIP与IKK复合体之间的相互作用。1.2体外实验明确IKIP与IKK复合体的相互作用;将重组蛋白质IKIP1和IKKβ在体外结合反应体系中混合孵育,使用IKKβ抗体做Co-IP,通过WB检测两者结合情况。1.3免疫荧光实验明确IKIP在细胞内的定位及其与IKKβ的共定位;将Flag标签的IKIP1表达质粒和Myc标签的IKKβ表达质粒共转染到Hela细胞,24小时后多聚甲醛固定细胞,分别用一抗IKIP、IKKβ、DPI和荧光二抗抗体标记IKIP、IKKβ、ER。共聚焦显微镜观察IKIP在细胞内的定位及其与IKKβ的共定位情况,IKIP(红色)、IKKβ(绿色)、DPI(ER Marker,绿色)、DAPI(细胞核,蓝色)。1.4寻找相互结合的作用区域;将Myc标签的IKIP1和IKIP2表达质粒分别与Flag-IKKβ、Flag-IKKβ-KD、Flag-IKKβ-HLH、Flag-IKKβ-LZ 表达质粒共转染到 HEK293T 细胞,24 小时后提取细胞蛋白,使用Myc标签抗体做Co-IP,通过WB检测结合情况;将Flag-IKKβ 表达质粒与 Myc-IKIP1、Myc-IKIP2、Myc-IKIP1(99-377)、Myc-IKIP2(99-350)表达质粒共转染到HEK293T细胞,24小时后提取细胞蛋白,使用Flag标签抗体做Co-IP,通过WB检测结合情况。2.IKIP调节NF-κB活化和炎症反应。2.1 IKIP对体外炎症反应的影响;取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠的原代腹腔巨噬细胞LPS在在(200ng/ml)、PGN(50 mg/ml)、poly(I:C)(20mg/ml)刺激指定时间点,收取细胞的上清,ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-6的分泌情况;提取细胞的mRNA,RT-PCR检测Tnfα、Il-6、Cxcl1和Nfkbiz mRNA水平的表达情况。同时,在THP1细胞系中转染IKIP siRNAs,48h后LPS(200ng/ml)刺激2h,提取细胞mRNA,通过RT-PCR检测细胞中TNF-α,IL-6mRNA水平的表达况。2.2 IKIP对体内炎症反应的影响;取Ikipfl/fl小鼠Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠腹腔注射LPS(20mg/kg),4h后取血清和肺脏组织。ELISA检测血清中TNF-α和IL-6的表达情况;HE染色检测肺脏的组织病理损伤情况和炎性细胞浸润情况。2.3 IKIP对NF-κB活化的影响将NF-κB报告基因表达质粒和不同浓度IKIP表达质粒分别在HEK293T,HEK293-TLR4/TLR2 细胞系中共转染,24h 后,分别用 TNF-α(20 ng/ml)、LPS或PGN刺激指定时间点,通过报告基因检测NF-κB的活化情况;HEK293T细胞系中NF-κB报告基因质粒和信号通路接头分子表达质粒与不同浓度的IKIP表达质粒共转染,24h后报告基因检测NF-κB的活化情况。2.4 IKIP对p65入核的影响取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠的原代腹腔巨噬细胞,LPS刺激刺激指定时间点,分别提取细胞质和核蛋白,通过WB分析p65和IRF3入核情况。2.5 IKIP对NF-κB信号通路中分子磷酸化的影响;取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠的原代腹腔巨噬细胞,分别用LPS、poly(I:C)、IL-1β(10ng/ml)和TNF-α刺激不同时间点,提取细胞蛋白,通过WB检测NF-κB信号通路中IKKα/β、p65、IκB的磷酸化,IFN-β信号通路TBK1,IRF3的磷酸化;MAPK信号通路中JUNK、ERK和p38的磷酸化。将IKKβ表达质粒在HEK293T过表达诱导信号通路的活化,同时梯度转染IKIP表达质粒,提取细胞蛋白,通过WB测IKKα/β的磷酸化;HEK293-TLR2细胞系梯度转染IKIP表达质粒,24h后,PGN刺激2h,提取细胞蛋白,通过WB检测IKKα/β的磷酸化。2.6IKIP的作用靶点;HEK293T细胞中,NF-κB报告基因表达质粒与NF-κB信号通路中接头分子表达质粒共转染,报告基因检测NF-κB启动子活性;HEK293T细胞中,TBK1和IKIP表达质粒共转染,24小时后提取细胞蛋白,通过WB检测TBK1的磷酸化;HEK293T细胞中,IRSE报告基因质粒与TBKI表达质粒共转染,同时转染IKIP表达质粒或空载体质粒,利用报告基因检测IRSE启动子活性。2.7 IKIP调节NF-κB信号通路的功能域。将IKIP1和IKIP2表达质粒及其对应的突变株表达质粒在HEK293-TLR2细胞系中过表达,24h后,PGN刺激2h,提取细胞蛋白,通过WB检测IKKα/β的磷酸化;将NF-κB报告基因表达质粒和IKIP两个剪接体表达质粒及其突变株表达质粒在HEK293T细胞系中共转染,TNF-α刺激或转染信号通路接头分子诱导信号通路的活化,报告基因检测NF-κB启动子活性。3.IKIP在NF-κB信号通路中的作用机制。3.1 IKIP对IKK同源或异源二聚体形成的影响;HEK293T细胞中,Flag标签的IKKβ、HA标签的IKKα/β表达质粒与Myc标签的IKIP共转染,24小时后提取细胞蛋白,使用Flag标签抗体做Co-IP,通过WB检测IKKβ同源或异源二聚体的形成。3.2 IKIP对NEMO泛素化的影响;取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠的原代腹腔巨噬细胞,LPS刺激不同时间点,提取细胞蛋白,使用NEMO抗体做Co-IP,通过WB检测NEMO的内源泛素化。3.3 IKIP对IKK复合体形成的影响。HEK293T细胞中,Myc标签的IKKβ表达质粒与HA标签的NEMO表达质粒共转染,同时转染不同浓度IKIP表达质粒,提取细胞蛋白,使用Myc标签抗体做Co-IP,通过WB检测IKKβ与NEMO的结合情况;将体外重组蛋白质IKKβ和NEMO在体外结合反应体系中混合,同时加入不同浓度的重组蛋白质IKIP1孵育,使用IKKβ抗体做Co-IP,通过WB检测IKKβ与NEMO及IKIP的结合;取野生小鼠的原代腹腔巨噬细胞,LPS刺激不同时间点,提取细胞蛋白,用IKKβ抗体做Co-IP,通过WB检测内源IKKβ与NEMO或IKIP的结合;取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠的原代腹腔巨噬细胞,LPS刺激不同时间点,提取细胞蛋白,使用IKKβ抗体做Co-IP,通过WB检测IKKβ与NEMO结合。4.IKIP在LPS诱导的脓毒性休克模型和DSS诱导的结肠炎模型中的作用。取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠(雄鼠,8周龄,各10只),腹腔注射LPS(30mg/kg),观察小鼠的存活情况;取Ikipfl/fl小鼠和Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠(雌性,6周龄,各5只)喂养3%(wt/vol)DSS诱导结肠炎,每天监测小鼠体重、粪便浓度和潜血,5天后换清水继续饲养2天后处死小鼠,取小鼠的血清和结肠。ELISA检测血清中细胞因子TNF-α和IL-6的表达;测量结肠的长度并取结肠组织作病理切片HE染色,统计结肠长度变化并观察结肠组织的病理损伤情况和炎性细胞浸润情况。实验结果与结论1.IKIP 结合 IKKα/IKKβ。1.1 IKIP1和IKIP2都可以结合IKKα/IKKβ但不与NEMO结合;1.2 IKIP1与IKKβ可以在体外反应体系中直接结合;1.3 IKIP大部分定位在内质网上且与IKKβ存在明显的共定位;1.4 IKIP通过N端1-99位的99个氨基酸与IKKβ的LZ和HLH结合。综上所述,IKIP可以直接结合IKK复合体的催化亚基IKKα/IKKβ,但是不与调节亚基NEMO结合,这种相互作用主要依靠IKIP的N端结构域和IKKβ的LZ与HLH结构域。2.IKIP负调NF-κB活化和炎症反应。2.1 LPS、PGN、poly(I:C)刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞,Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠巨噬细胞中Tnα、Il-6、Cxcl1和Nfkbiz mRNA的表达量及巨噬细胞上清中TNF-α和IL-6分泌量明显高于Ikipfl/fl小鼠;THP1细胞转染干扰RNA敲低IKIP在细胞内表达水平,TNF-α和IL-6 mRNA表达升高;2.2腹腔注射LPS(20mg/kg),Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠血清中TNF-α和IL-6的表达量明显高于Ikipfl/fl小鼠;Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠肺脏组织中的炎性细胞浸润及组织损伤与Ikipfl/fl小鼠比较更加明显;2.3 IKIP抑制TNF-α诱导的NF-κB活化并存在剂量依赖性;LPS或PGN诱导的NF-κB活化同样被IKIP抑制;2.4 IKIP抑制LPS诱导的p65入核;而不影响LPS诱导的IRF3的入核;2.5 LPS、poly(I:C)、IL-1β 和 TNF-α 刺激原代腹腔巨噬细胞,Ikipfl/flLyz2-Cre 小鼠细胞的IKBα和p65的磷酸化水平比Ikipfl/fl小鼠高,而JNK、ERK、p38、IRF3和TBK1的磷酸化在不同小鼠间无明显差异;IKIP可以抑制IKKβ的自磷酸和PGN诱导的IKKα/β磷酸化;2.6IKIP负调IKKα/β和上游接头分子(TRIF、MyD88、TRAF6,、IKKα、IKKβ、p65)诱导的NF-κB活化不影响TBK1的功能。2.7 IKI1和IKIP2抑制PGN诱导的IKKα/β磷酸化而突变株不影响IKKα/β磷酸化;IKP1和IKIP2抑制NF-κB启动子活性而突变株不影响NF-κB启动子活性。综上所述,IKIP通过N端1-99位的99个氨基酸结合IKKα/β抑制其磷酸化进而并负向调节NF-κB活化和炎症反应。3.明确IKIP在NF-κB信号通路中的作用机制。3.1 IKIP不影响IKK同源或异源二聚体的形成;3.2 IKIP不影响NEMO的泛素化;3.3 IKIP抑制IKKβ与NEMO的结合;LPS刺激后,IKIP缺失促进了 IKKβ与NEMO的结合。综上所述,IKIP主要是通过与NEMO竞争结合IKKβ影响复合体的形成从而抑制NF-κB活化和炎症反应。4.明确IKIP在LPS诱导的脓毒性休克模型和DSS诱导的结肠炎模型中的作用。LPS诱导的脓毒性休克模型中,与Ikipfl/fl小鼠相比npIipfl/flLyz2-Cre小鼠更易感,死亡率更高;DSS诱导的结肠炎模型中,与Ikipfl/fl小鼠相比,Ikipfl/flLyz2-Cre小鼠体重降低更快;疾病患病更加严重;同时Ikipfl/flILyz2-Cre小鼠血清中细胞因子TNF-α和IL-6的表达水平更高;与Ikipfl/fl小鼠相比,Ikipfl/flILyz2-Cre小鼠的结肠更短且病理损伤更严重。综上所述,敲除IKIP增加了小鼠在LPS诱导的脓毒性休克模型和DSS诱导的结肠炎模型中的易感性。创新性IKIP作为一个新发现的分子,其功能的研究尚不完善,我们深入研究了 IKIP对NF-κB活化和炎症反应的负向调控作用,同时解释了 IKIP负向调节NF-κB活化和炎症的机制,丰富了 NF-κB的负向调节机制,并为IKK的激活调控提供了新的分子机制,可能有助于炎症性疾病新治疗策略的发展。