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葡萄糖异构酶（glucose isomerase,GI）可将D-葡萄糖异构化为D-果糖,获得的高果糖浆（high fructose corn syrup,HFCS）作为甜味剂可应用于食品等诸多领域。根据果糖含量的不同,高果糖浆可分为HFCS-42、HFCS-55和HFCS-90。其中,HFCS-55的甜度优于蔗糖,是市场上的主流产品。但是,目前的商业化GI只能生产HFCS-42,需要经过色谱分离浓缩获得HFCS-90,然后经勾兑等步骤才能获得HFCS-55。为了实现一步生物转化法制备HFCS-55,本论文开展了以下研究:挖掘新型耐高温葡萄糖异构酶的基因。以嗜热葡萄糖异构酶Thermotoga maritima GI（TmGI）氨基酸序列为模板,在NCBI中进行BLAST,选取具有高同源性、未被研究的Thermoanaerobacterium xylanolyticum GI（TxGI）、Thermus oshimai GI（ToGI）、Geobacillus thermocatenulatus GI（GtGI）和Thermoanaerobacter siderophilus GI（TsGI）,进行全基因合成、重组质粒的构建,实现其在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中的成功表达。通过酶活测定,ToGI和Ts GI重组菌的酶活分别为2.42和2.54 U/（mg·total protein）,高于TxGI和GtGI重组菌,因此,最终选择To GI和TsGI为研究对象进行后续研究。ToGI和TsGI的纯化与酶学性质研究。收集发酵的菌体,经细胞破碎、热处理去除杂蛋白和nickel-NTA柱亲和层析,获得纯化的酶蛋白。酶学性质研究表明,Mn2+和Mg2+分别对ToGI和TsGI酶活有最大促进作用;ToGI的最适反应温度为95oC,优于TsGI的90oC;To GI添加20 mM Mn2+,于85oC保温48 h,仍保持80%初始酶活,该结果明显优于TsGI和已报道的耐高温葡萄糖异构酶催化剂;两酶的最适反应pH分别为8.0和6.5;ToGI和TsGI对D-葡萄糖的Km分别为81.46 mM和199.03 mM,表明ToGI具有较好的底物亲和力。ToGI的kcat/Km值为21.77 min-1·mM-1,高于TsGI的14.54 min-1·mM-1,表明ToGI比Ts GI具有更高的催化效率。综上所述,选择热稳定更好、催化效率更高的ToGI开展下一步研究。重组菌E.coli BL21（DE3）/pET28b/To GI发酵产酶条件与转化条件优化。通过优化实验,确定To GI重组菌的最佳产酶条件为诱导温度28oC、诱导剂（IPTG）终浓度0.1 mM、发酵培养基中添加5 mM Mn2+;将最优转化体系放大100 mL,包括20 g/L湿菌体、添加10 mM Mn2+和200 g/L底物,于95oC和pH 7.5条件下转化4 h,D-果糖产率高达57.34%。对ToGI进行同源建模和分子对接,经过理性分析,选择对影响酶活的关键位点进行定点突变,具体为:Trp136Phe、Glu216Asp、Thr352Asp、Leu342Ile、Val228Cys。最终,Val228Cys和Thr352Asp突变后活力有略微提高,分别为初始酶活的107%和104%。通过上述研究,本研究筛选到新型耐高温葡萄糖异构酶ToGI,与现有和报道的耐热酶相比,具有更为突出的热稳定性;运用最优菌体发酵与转化条件,实现了一步生物转化法生产HFCS-55,该工艺可简化后续浓缩分离步骤,有助于节能降耗;通过蛋白质工程手段,初步发现了对酶活影响较大的关键氨基酸位点,为后续更为深入的改造提供理论依据。