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目的: 蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,并对蛋白质的功能和结构有重要的影响。岩藻糖基转移酶家族在多种肿瘤中表达异常,但其在肺癌中的表达情况及其作用机制尚不清楚。本实验在前期收集临床组织标本的基础上,筛选肺癌组织中特异表达的岩藻糖基转移酶,并构建FUT2低表达肺腺癌A549细胞株,观察FUT2的表达变化对A549细胞生物学功能的影响,为肺腺癌检测诊断及其分子靶向治疗提供新的方法和理论依据。 方法: 第一部分: (1)Trizol法提取了肺癌新鲜配对组织的mRNA,逆转录为cDNA后,用实时荧光定量PCR(SYBR Green法)分别检测FUT2(22例)/FUT4(10例)/FUT7(19例)/FUT8(16例)的mRNA在癌组织和邻近正常组织中的表达。 (2)用Western Blot分析肺癌新鲜配对组织中FUT2/FUT8蛋白表达水平。用Image J软件对目的蛋白FUT2(21例)/FUT8(13例)及内参Tubulin/GAPDH蛋白进行相对定量,分析FUT2/FUT8蛋白的表达情况。 (3)用HE染色法对收集到的4对肺腺癌配对组织切片进行染色,确定标本的正确性;并采用SABC免疫组化法检测FUT2/FUT8的蛋白表达情况。 第二部分: (1)把FUT2的RNA干扰质粒载体和对照无义序列载体用脂质体稳定转染进肺腺癌A549细胞株,并采用G418抗生素筛选出转染阳性细胞单克隆。 (2)分别采用实时荧光定量PCR(SYBR Green法)检测目的基因mRNA表达、Western Blot检测目的蛋白的表达,衡量FUT2 shRNA干扰效果。 (3)CCK-8法检测FUT2干扰后对A549细胞增殖能力的影响,实时荧光定量PCR(SYBR Green法)检测细胞周期蛋白CyclinD1基因水平表达情况。 (4)划痕实验和Transwell小室法检测FUT2对细胞迁移能力的影响。 (5)实时荧光定量PCR(SYBR Green法)和Westem Blot实验检测相关粘附因子E-cadherin、β-catenin的基因和蛋白水平表达情况,并运用免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下观察β-catenin蛋白在FUT2稳定干扰A549细胞内的分布情况。 (6)Western Blot实验检测基质金属蛋白酶家族MMP2/MMP9的蛋白表达的变化。 (7)实时荧光定量PCR(SYBR Green法)和Western Blot实验检测凋亡因子BCL-2基因和蛋白水平表达情况。 结果: 1.在肺癌标本中,FUT7 mRNA在癌组织表达有所降低,FUT8 mRNA表达有所升高。在肺腺癌标本中,FUT2/FUT8 mRNA呈高表达趋势; 2.在肺癌标本、肺腺癌标本中FUT2/FUT8蛋白水平都呈高表达趋势; 3.经HE染色确诊的肺腺癌组织标本切片中FUT2/FUT8蛋白水平都呈高表达趋势; 4.FUT2干扰质粒载体已成功转入肺腺癌A549细胞并得到稳定表达的细胞株; 5.FUT2干扰后能抑制A549细胞的增殖能力,CyclinD1 mRNA表达降低; 6.FUT2低表达细胞迁移能力有所降低; 7.FUT2低表达细胞中E-cadherin mRNA和蛋白表达上调;β-catenin mRNA表达明显上调,其总蛋白水平无明显趋势;β-catenin在肺腺癌A549细胞膜上积聚,表达量有所升高; 8.基质金属蛋白酶家族MMP2/MMP9的蛋白水平表达降低; 9.FUT2干扰后抗凋亡因子BCL-2基因水平明显下调,而蛋白水平有所降低但无统计学意义。 结论: 本研究通过临床组织标本中特异性岩藻糖基转移酶的筛选,发现FUT2/FUT8在肺癌及肺腺癌中呈现高表达趋势;同时成功构建FUT2靶向干扰肺腺癌A549细胞株的稳定转染模型。综合所有实验结果分析表明,下调FUT2的表达,肺腺癌A549细胞的无限增殖和迁移侵袭能力受到抑制,并对细胞的凋亡能力有一定的影响,由此可初步推断FUT2可能在肺腺癌的迁移侵袭过程中具有重要的作用。本研究为肺腺癌诊断和治疗的新靶点提供了科学依据,还将为阐明肺腺癌的发生发展提供新的信息。