雌激素受体（estrogen receptor, ER）是核受体超级家族成员之一,主要调节与雌激素相关的基因转录,在乳腺癌的发生发展过程中起着重要作用。目前认为,ER是乳腺癌治疗的靶标和预后的指标之一。ER包括两种亚型:ERα和ERβ,二者都由A、B、C、D、E和F六个结构域组成,含两个转录激活区,即AF1和AF2。AF1具有雌激素不依赖的转录激活功能,位于A/B区;AF2具有雌激素依赖的转录激活功能,位于E/F区。AF1和AF2的有效转录激活依赖于与其它蛋白质的相互作用。目前乳腺癌的内分泌治疗主要是通过降低ER的转录活性而实现。因此,参与调节ER转录活性的蛋白质因子的发现及其相关功能的研究对于阐明雌激素信号通路的调控机制,有效开发治疗乳腺癌等雌激素相关疾病的药物具有重大意义。为深入研究ERβ在雌激素应答基因转录调节中的作用方式,发现新型转录共调节因子,本实验室早期以ERβ的AF2区段为诱饵,利用酵母双杂交技术从人乳腺cDNA文库中筛选到了一种未见报道的与ERβ相互作用的蛋白质,我们暂命名为ERIP2（ERβinteracting protein）。ERIP2是一个功能未知的候选新基因,共编码334个氨基酸,富含精氨酸（arginine）和丝氨酸（serine）。生物信息学分析发现其第180-224区段能够形成螺旋卷曲（coiled coil）结构,参与蛋白质间的相互作用;此外,该分子中还含有三个潜在的SUMO化修饰位点。为了更深入研究ERIP2分子的功能,前期实验室人员又以其全长分子为诱饵,从人的乳腺cDNA文库中钓取相互作用蛋白,得到了SUMO化修饰的相关蛋白—SUMO1、UBC9及PIAS。为进一步确认ERIP2与ERβ及SUMO化相关分子之间存在特异性结合作用,我们构建了相关分子的真核及原核表达载体,利用表达的蛋白进行了GST沉降和免疫共沉淀实验。结果表明,ERIP2确实分别与ERβ及SUMO化相关分子（SUMO、UBC9和PIAS1）存在相互作用,与酵母双杂交结果相一致。而且通过免疫共沉淀分析,我们还将结合ERβ的ERIP2结构域初步定位在121～224aa之间。此外实验还发现,ERIP2与ERβ的结合作用无激素依赖性;且ERIP2只与ERβ发生特异性结合,而与ERα无明显的体内结合,这种特性使得该因子的深入研究可能对进一步了解乳腺癌的发生、发展机理具有重要意义。为探讨ERIP2及ER是否在细胞内发生SUMO化修饰及其产生的影响,我们利用Western blotting进行了初步检测,实验结果进一步验证了ERIP2很可能是SUMO化修饰过程中的新成分。而免疫共沉淀实验表明,SUMO化严重削弱了ERIP2与ERβ之间的结合。同时根据Western blotting结果,我们推测ERβ可能也是SUMO化修饰的底物蛋白之一,因此SUMO化影响ERIP2与ERβ之间的相互作用可能同ERIP2与ERβ相互竞争结合SUMO1有关。由于ER在雌激素信号通路中发挥重要作用,因此,ERIP2有可能通过与ER相互作用而参与雌激素信号通路的调控。为探讨ERIP2的生物学功能,我们进行了一系列活性实验。结果表明,ERIP2可以激素依赖的方式改变ER的转录活性,并且其改变具有剂量依赖效应;同时我们还发现ERIP2对转录活性的影响具有细胞特异性,它可以升高293T中的ER转录活性却降低乳腺癌细胞中ER的转录活性;而且转录活性的变化趋势也随ER下游基因的不同而不同。因此,这种因子的深入研究将对于阐明乳腺癌可能的发生发展机理产生重要影响,也可能为今后乳腺癌治疗提供新的有利线索。此外,实验结果还显示,SUMO化修饰能显著升高ER的转录活性,并且SUMO化对ER的转录活性的影响要远大于ERIP2降低ER转录活性的作用。本部分实验验证了ERIP2及SUMO化相关分子与ER之间存在着与物理性结合作用相一致的功能性相互作用。为了更深入研究ERIP2基因的功能,我们构建了带GST标签的ERIP2全长及片段的原核表达载体,并对ERIP2（180～224aa）的GST融合蛋白进行纯化,免疫Balb/c小鼠获得了抗ERIP2的多克隆抗体。经Western blotting鉴定,发现自制的免疫血清具有较好的特异性,而且抗体效价也较高。之后,我们利用该抗体检测了ERIP2在大鼠不同组织中的分布以及不同乳腺癌细胞株的表达情况,提示ERIP2可能在生理和病理条件下具有普遍作用。综上结果表明,ERIP2很可能是雌激素信号通路中的一个新型共调节因子,并且在细胞内发生了SUMO化修饰;该蛋白通过与ER及SUMO的相互作用影响ER下游信号的传递。因此对ERIP2更深入的研究将有助于进一步了解ER信号通路的调控机制,并可能拓展SUMO化修饰的蛋白质组学研究;这些都将为阐明乳腺癌发生、发展机制奠定了良好的基础,也将为乳腺肿瘤的治疗提供新的靶标和思路。