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截止目前,还没有任何关于具备生殖嵌合能力的猪胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)和诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)建系成功的报道。相较于已经成熟建立并且应用的小鼠多能性干细胞系,确定并解决建立高质量的猪多能性干细胞系的症结所在不仅会极大地拓宽我们对于干细胞的认识,也能为完善整个大动物包括人类多能性干细胞建系以及医学研究提供强大的理论支持。自猪iPS细胞建系和多能性维持研究开展以来,至今还没有无外源基因整合的猪iPS细胞建系成功的报道,也没有来源于猪iPS细胞具备生殖系传递能力的核移植克隆猪和嵌合体猪生产的报道。因此,关于猪iPS细胞的多能性维持机制和分化发育潜能的研究都受到了很大的制约。针对以上弊端,本论文研究分别采用episome瞬时表达载体,piggyBac、Cre/loxP外源基因可切除型,以及DOX、TMP外源基因表达可调控型等非病毒重编程系统在2i/LIF培养体系中进行猪体细胞重编程。诱导产生的猪iPS细胞在外在形态特征、多能性蛋白免疫荧光染色、多能性基因表达以及X染色体重新激活等细胞多能性分析中,都表现出类似于小鼠ES/iPS细胞的多能性状态。这些猪iPS细胞核型正确,能够高效率地进行基因修饰,并且具备很强的畸胎瘤形成和三胚层分化潜能。在利用核移植、胚胎注射和胚胎聚合等技术手段尝试制备iPS细胞来源的成体克隆猪和嵌合体猪实验中,这些猪iPS细胞能够高效率地产生核移植重构囊胚和嵌合体囊胚,甚至能够参与嵌合囊胚中内细胞团和滋养层细胞的形成,但是其在体内发育潜能却受到了明显的阻滞。针对猪iPS细胞内残留外源诱导基因的分析结果表明,外源诱导基因特别是OCT4基因能够稳定地整合在猪iPS细胞基因组上并获得较高水平的表达,而猪iPS细胞内源OCT4基因则几乎不表达。猪iPS细胞及其重构胚胎异常表观修饰的分析结果表明,猪iPS细胞及其重构胚中OCT4等与多能性维持相关的干性基因以及GTL2等与分化发育相关的印记基因启动子区域存在异常高甲基化修饰,稳定分化的猪iPS细胞X染色体存在异常激活现象。为了更进一步地探究猪iPS细胞在体内分化发育阻滞的原因,我对猪iPS细胞、稳定分化的猪iPS细胞以及猪iPS细胞来源的成纤维细胞系进行了转录组水平RNA-seq数据的分析。结果证实利用分化培养体系对猪iPS细胞进行诱导分化,并不能获得真正意义上的类似于成纤维细胞的分化细胞。这些稳定分化的猪iPS细胞只是形态上发生了改变,其基因表达模式并没有发生实质性的改变,利用这些稳定分化的猪iPS细胞仍不能获得性成熟的克隆猪个体。以上实验结果说明,由外源诱导基因的持续表达而引起的不完全重编程是造成猪iPS细胞体内分化发育阻滞的主要原因之一。而造成这些猪iPS细胞体内发育异常又与猪体细胞重编程过程中所发生的DNA甲基化、基因印记以及X染色体失活等表观现象异常有十分重要的关联。这些异常表观现象的途释与解决对于建立更加完善的重编程方法和培养体系都具有重要的研究意义。