双酚A(bisphenol A, BPA)大量使用于食品和饮料的碳酸聚酯包装材料、树脂内膜和牙齿固封剂,以及各种化学日用品的添加材料。来自一些发达国家的调查显示长期以来人们一直暴露于低剂量的BPA中。美国疾病控制中心的报告显示,来自394份被测人群尿液样本中有95%检测出BPA。BPA是一种兼有拟雌激素、抗雌激素和抗雄激素活性的环境内分泌干扰物,它不仅可以低亲和性与雌激素受体结合,还可与雄激素受体结合而干扰内源性激素对脑的调节作用。目前大部分关于BPA的研究大多集中在围生期和发育期,对成年期的研究还很少,并且本实验室前期工作表明,围生期和青春期BPA暴露影响子代小鼠的学习记忆、情感和多种社会行为及其性别分化。因此本研究将探讨BPA暴露对成年期小鼠的影响。海马的突触可塑性与学习记忆行为密切相关,雌激素可通过正向调节突触发生、神经环路联系和突触传递而促进突触可塑性。最近,有人发现BPA可以干扰性激素的突触重塑作用。在大鼠和灵长类,BPA可抑制雌激素和雄激素诱导增加的海马和前皮层70-100%的棘突触,BPA暴露数天促进新生大鼠小脑蒲肯野氏细胞的树突生长和下丘脑神经元树突密度。我们以往的研究发现BPA快速增加体外海马神经元树突丝密度和运动性。突触界面是一个对行为训练和化学物质非常敏感的结构,其中的一些参数,如突触间隙(synaptic cleft)、突触前活性带(synaptic active zone)、突触后致密体(postsynaptic density, PSD)和突触界面曲率(curvature of synaptic interface)可因刺激而发生改变。雌激素改善卵巢摘除小鼠记忆行为的同时伴随有海马和前皮层突触界面结构的变化,包括突触间隙的缩小和PSD厚度增加。位于突触后膜上的PSD含有细胞骨架和脚手架蛋白、谷氨酸受体、钙调蛋白结合蛋白、离子通道和信号分子等多种蛋白,这些蛋白表达的改变和相互作用均可影响突触活性和可塑性,同时也改变PSD的厚度。那么,BPA影响成年神经行为是否与突触界面结构修饰的改变有关呢?本研究通过将成年小鼠长期暴露于低剂量BPA,研究BPA对成年小鼠活动性、探究、学习记忆等行为的影响,观察海马CA1区神经元突触密度和突触界面结构的改变；进一步通过Western blot检测海马突触蛋白Synapsin I和PSD-95(postsynaptic density protein of95kDa),以及兴奋性氨基酸NMDA和AMPA受体表达的改变,探讨BPA影响行为和突触结构可塑性的机制。方法：清洁级8周龄ICR雌雄小鼠,雄性体重30-35g,雌性体重25-30g,购于浙江省金华市药检所。小鼠雌雄分开饲养,饲养环境为昼夜12h交替,饲养室温度控制在18-22℃,湿度在50%-60%,水和食物自由摄取。小鼠适应2周后,随机分为BPA暴露组(0.4,4,40mg/kg/day)(BPA,99.8%,上海生工生物工程技术服务有限公司)和溶媒对照组(金龙鱼食用油)。每天上午8点灌胃染毒,持续12周。染毒结束3天后,按顺序分别检测开场行为,水迷宫和被动回避。另取小鼠进行分别做超薄切片电镜观察海马突触界面结构、蛋白免疫印迹(western-blot)技术检测海马NMDA受体NR1和AMPA受体GluR1亚基表达和突触蛋白PSD-95和Synapsin-1表达；同时检测体重、血清雌激素、雄激素水平。所得的数据用平均值±标准误表示,采用SPSS18.0软件包,水迷宫四天训练结果采用重复三因素(BPA暴露×性别×训练天数)方差分析(three-way ANOVA),其它行为结果、体重和突触形态测算采用重复双因素(BPA暴露×性别)方差分析(two-way ANOVA),生殖器官系数、血清激素水平和Western blot结果用单因素(BPA暴露)方差分析(one-way ANOVA)。然后进行事后检验(Post-hoc test, LSD)。P<0.05作为具有统计学差异显著性。结果：1.BPA暴露前(10周龄)小鼠体重没有明显的性别差异,随后,雄鼠的体重增长加速,到22.5周龄时,雄鼠体重明显高于雌鼠,与同性别对照组相比,0.4和40mg/kg/day BPA暴露12周显著增加雄鼠的体重(p<0.05)。BPA暴露对雌、雄小鼠生殖器官／体重比、雌鼠血清和脑内雌二醇水平均没有显著影响,但0.4和4mg/kg/day BPA显著降低雄鼠血清和脑的睾酮水平(p<0.05)。2.开场行为结果表明：一分钟跑格数雌雄组内均没有差异,而雄性在一分钟跑格数据中显著高于雌性(0,0.4,40mg/kg/d,p<0.05),而测试五分钟跑格数得出,雌雄小鼠组内组间都没有差异,BPA暴露消除了小鼠在五分钟跑格数中的性别差异。BPA暴露(0.4、4、40mg/kg/day)增加雄性的站立次数和理毛频率,BPA(4mg/kg/day)却显著减少雌鼠的站立次数。在4天的水迷宫训练中,各组小鼠的游泳平均速度没有明显差异,但每天探索平台的平均距离表现为随训练天数的增加而缩短,说明各组小鼠都具有一定的空间学习和记忆能力,但正常雌鼠探索平台所需的平均距离要大于雄鼠(第3、4天,P<0.0习,表明正常状态下雄鼠具有更好的空间学习记忆能力。BPA暴露显著延长雄鼠搜索平台的平均距离(P<0.05),但对雌鼠没有影响。表明长期BPA暴露性别特异性地损伤成年雄鼠的空间记忆能力,并因此消除空间学习记忆的性别差异。跳台实验结果显示：电击前,各组小鼠步下平台的潜伏期没有差异,均可在5sec内跳下平台。电击后24h,各组小鼠步下平台潜伏期均显著延长,并表现出性别差异(P<0.001,雄鼠>雌鼠)。与同性别对照组相比,40mg/kg/day BPA明显缩短了雄鼠电击后的步下潜伏期(P<0.05)；表明长期BPA暴露性别特异性地损伤成年雄鼠的被动回避记忆能力,并因此消除其性别差异。3.突触数密度和突触界面结构参数检测结果显示0.4和40mg/kg/day BPA暴露显著降低了雄鼠海马CA1区突触数密度(P0.01),并因此诱导成年小鼠海马CA区突触密度的性别差异(P<0.01,雄鼠<雌鼠)。与同性别对照组相比,BPA显著加宽雄鼠海马的突触间隙宽度(P<0.05,P<0.01),缩短其活性带长度(0.4mg/kg/day,P<0.05),并减小PSD厚度(0.4、40mg/kg/day, P<0.05),但对雌鼠没有影响。以上结果表明长期BPA暴露主要影响成年雄鼠的突触形成和结构修饰,该结果与BPA对记忆行为的影响相一致。4.进一步分析BPA损伤学习记忆和突触形成的机制,本研究采用Westernblot分析了长期BPA暴露后,海马突触标志性蛋白和谷氨酸NMDA和AMPA受体表达的变化。结果表明,BPA暴露性别特异性地抑制突触蛋白和受体的表达,主要表现为3个剂量BPA均下调雄鼠Synapsin I和PSD-95表达(P<0.05,P<0.01),0.4和40mg/kg/day BPA下调NMDA受体NRl亚基表达(P<0.05,P<0.01),但对雌鼠的这些蛋白没有明显影响。以上结果提示成年雄鼠海马的突触蛋白和NMDA受体对BPA更为敏感,该结果与BPA引起的突触形成和结构变化相一致的。结论：成年时期长期暴露于低剂量BPA可性别选择性地损伤雄性小鼠的学习记忆行为和负性改变海马神经元的突触可塑性,突触蛋白和NMDA受体表达水平的下调可能参与以上过程。