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目的比较雾化吸入及注射两种不同给药方式下,汉防己甲素对一次性气管滴注博来霉素导致的SD大鼠肺纤维化模型的干预作用;通过细胞和整体实验初步探究其可能的作用机制,为临床治疗肺纤维化安全合理用药提供参考,为药物的开发提供依据。方法1 雾化吸入汉防己甲素对博来霉素所致肺纤维化大鼠的药效学研究一次性气管滴注博来霉素(5 mg·kg-1)对SD大鼠进行造模,分别采用雾化吸入及注射的方式,连续给予汉防已甲素干预,分别在14天及28天处死动物,动态地进行肺脏形态的大体观察,计算肺系数,利用肺功能检测仪记录各组大鼠肺功能相关指标,左肺HE,MASSON染色,进行病理学观察,右肺通过ELISA法观察肺组织中HYP含量变化。2 汉防己甲素改善博来霉素所致肺纤维化大鼠的机制研究ELISA法检测各组大鼠肺组织中Col-I及FN含量,Western Blot法测定各组大鼠肺组织中TGF-β1,α-SMA及Vimentin含量,观察上述蛋白水平的变化。3 TGF-β1刺激对A549,MRC-5及PMVEC细胞中细胞外基质的影响CCK-8法筛选TGF-β1对三种细胞的安全浓度。连续刺激24h后,ELISA法检测细胞上清中Col-I及FN含量变化,Western Blot法测定细胞中α-SMA及Vimentin含量变化。4 汉防己甲素治疗肺纤维化的体外机制研究根据第三部分中所得数据,采用适宜浓度的TGF-β1与不同浓度的汉防己甲素共同刺激MRC-5细胞,CCK-8法筛选安全的给药浓度及给药时间,ELISA法检测细胞上清中Col-I及FN含量变化,Western Blot法测定细胞中α-SMA及Vimentin含量变化。流式细胞术观察对细胞凋亡的影响。结果1 汉防己甲素对博来霉素所致肺纤维化大鼠有一定的治疗作用气管滴注博来霉素会导致大鼠肺纤维化。模型组与假手术组比较,14天时:肺系数升高至11.14%(P<0.01),呼吸频率为96.81,表现为明显加快(P<0.05),气道阻力略有升高,无统计学差异,潮气量及动态肺顺应性分别降低为 0.82 mL 及 0.13 mL·(cm H2O)-1(P<0.01),HYP 含量增加加至 0.15%(P<0.05),病理可见,肺泡间隔增厚,炎症细胞浸润,纤维组织明显增生;28天时:肺系数依然显著高于假手术组,为9.09%(P<0.01),但略低于14天组,肺功能进一步下降,各项指标与假手术组相比,均出现统计学差异,且潮气量、气道阻力及动态肺顺应性差异明显(P<0.01),HYP含量进一步升高,显著高于假手术组的0.062%(P<0.01),病理可见肺泡间隔重度增厚,炎症细胞大量浸润,纤维组织重度增生。与模型组比较,连续给予汉防己甲素雾化吸入14天,大鼠肺系数降低至7.79%(P<0.05),大鼠动态肺顺应性升高至0.25 mL·(cm H2O)-1(P<0.05),呼吸频率,气道阻力及潮气量等肺功能也略有改善,HYP含量略有降低,均无统计学差异,病理可见轻微炎症细胞浸润及轻微纤维组织增生;连续给予汉防己甲素注射14天,大鼠肺系数下降至7.44%(P<0.05),各项肺功能指标略有改善,HYP含量略有降低,均无统计学差异,病理可见轻度炎症细胞浸润及轻度纤维组织增生;连续给予汉防己甲素雾化吸入28天,大鼠肺系数未出现进一步升高,与模型组有明显差异(P<0.05),大鼠呼吸频率略有降低,肺顺应性及潮气量略有升高,无统计学差异,气道阻力下降为0.88 cm H2O·(s·mL)-1(P<0.05),HYP含量为0.089%,表达被明显抑制(P<0.05),病理可见轻微炎症细胞浸润及轻微纤维组织增生;连续给予汉防己甲素注射28天,大鼠肺系数略有增加,但仍低于模型组,二者无统计学差异,气道阻力明显下降,为0.89 cm H2O·(s·mL)-1(P<0.05),呼吸频率,潮气量及动态肺顺应性略有改善,无统计学差异,病理可见中度炎症细胞浸润及中度纤维组织增生。不同给药方式之间比较:注射组给药剂量为30 mg·kg-1,雾化组有效剂量为0.22 mg·kg-1,仅为注射组的1/136。与雾化组比较:注射组大鼠体重略微偏低,肺系数,肺组织中HYP含量及动物肺功能各项指标均接近,上述指标与雾化组均无统计学差异;但注射组部分动物在实验后期出现腹部胀大,肠腔积液严重,便秘严重,站立不稳等不良反应,且实验28天HE切片可见注射组大鼠肺组织中炎症细胞细胞浸润,肺泡间隔增厚,与雾化组有明显差异(P<0.05)。2 汉防己甲素可以抑制肺纤维化大鼠肺组织中细胞外基质的表达一次性气管滴注博来霉素14天后,模型组与假手术组比较,大鼠肺组织中TGF-β1含量明显升高(P<0.05),Col-I含量显著升高(P<0.01),FN含量明显增加(P<0.05),α-SMA水平明显提高(P<0.05),Vimentin水平显著提高(P<0.01);28天后,上述指标的分泌进一步被促进,均与假手术组有显著差异(P<0.01)。汉防己甲素可以抑制肺纤维化大鼠肺组织中相关细胞外基质水平的升高:与模型组比较,14天时对大鼠肺组织中Col-I,FN,α-SMA的含量略有抑制作用,能明显抑制TGF-β1及Vimentin水平(P<0.05);28天时,能明显降低大鼠肺组织中TGF-β1,Col-I,FN含量(P<0.05),显著抑制Vimentin水平(P<0.01),对α-SMA的表达略打抑制,但无统计学差异。3 TGF-β1激促进A549,MRC-5及PMVEC细胞中细胞外基质的表达适宜浓度的TGF-β1连续刺激24 h,能够使A549,MRC-5,PMVEC细胞上清中Col-I含量显著升高(P<0.01),细胞中α-SMA及Vimentin念量显著增加(P<0.01);可以显著促进A549,MRC-5细胞中FN的表达(P<0.01)。4 汉防已甲素可以抑制TGF-β1刺激的MRC-5细胞的作用汉防已甲素与TGF-β1共刺激24 h,对MRC-5细胞的半数抑制浓度为14.07μM。汉防己甲素可以显著抑制TGF-β1刺激所导致的MRC-5细胞中Col-I,FN,α-SMA 及 Vimentin 的增加(P<0.01)。单纯使用TGF-β1刺激并不会使MRC-5细胞凋亡,凋亡率为1.93%,甚至低于空白组的2.27%,同时加入汉防己甲素共刺激,凋亡率为1 7.53%—43.8%,对细胞的促凋亡作用明显(P<0.01)。结论1 汉防己甲素能够缓解肺组织病变程度,改善肺纤维化大鼠肺功能,降低肺系数,减少HYP的分泌,且这种保护在肺纤维化形成初期也有一定作用。2 相对于注射给药,雾化吸入治疗与其药效基本一致,但雾化吸入给药的有效剂量为0.22 mg·kg-1,仅为注射组剂量的1/136,且雾化组动物状态,肺组织病变程度及部分肺功能指标优于注射组。3 汉防己甲素可能是通过减少肺组织中TGF-β1含量,促进活化的成纤维细胞凋亡等多种途径,抑制Col-I,FN等细胞外基质的堆积,从而实现对肺纤维化的防治作用。