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背景宫颈癌是发病率仅次于乳腺癌的女性常见恶性肿瘤。高危型人乳头瘤病毒(HPV)的持续性感染是宫颈癌及癌前病变发生的首要原因,其中80%以上宫颈癌的发生与高危型HPV16和18有关。当患者持续性感染高危型HPV16/18时,E6蛋白在宫颈上皮细胞内大量合成,并通过抑制抑癌因子P53活性、激活端粒酶等途径引起宫颈上皮细胞发生恶性转化,最终导致宫颈癌前病变及宫颈癌。因此,通过检测宫颈上皮脱落细胞内HPV16/18型E6蛋白含量可为患者宫颈癌及癌前病变的早期筛查及辅助诊断提供依据。但由于以宫颈上皮脱落细胞为检测样本,受到取样误差的影响大,临床上缺乏对其进行快速定量检测的方法。目的建立以管家蛋白β-Actin为内参的人宫颈上皮细胞中HPV16/18型E6蛋白荧光免疫层析联合定量快速检测方法,为患者宫颈癌及癌前病变的早期筛查及辅助诊断提供一种灵敏度高,特异性好,操作简便成本低廉的检测手段。方法1.HPV18 E6蛋白重组表达及纯化:将p ET28a-HPV18E6质粒转入BL21(DE3)菌中,采用单因素变量法,对诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度进行优化并表达目的蛋白,利用Ni亲和层析法纯化。2.参考品研制:依据CNAS-GL29:2010,使用标准品保存液稀释HPV16/18型E6蛋白抗原、β-Actin蛋白研制室内参考品。3.HPV16/18型E6蛋白荧光免疫层析联合检测试纸条的研制:使用荧光微球分别标记抗β-Actin单克隆抗体、抗HPV16 E6与HPV18 E6单克隆抗体,在同一NC膜上包被HPV16 E6配对单克隆抗体做检测线T1,HPV18 E6配对单克隆抗体做检测线T2,β-Actin配对单克隆抗体做内参A线,利用荧光免疫层析原理和双抗体夹心法研制试纸条。4.试纸条工艺优化及性能评价:对研制试纸条的主要原材料及工艺进行优化;并通过检测线性范围、精密性、准确度、稳定性,以及临床实验进行性能评价。结果1.重组菌在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导4 h,可大量表达分子量为18 KDa的HPV18 E6重组蛋白;经Western blot证实具有免疫原性;亲和纯化后纯度达到95%。2.制备了包含线性范围、精密性等性能评价参考品共45份。3.建立了以管家蛋白β-Actin为内参的人宫颈上皮细胞中HPV16/18型E6蛋白的荧光免疫层析联合定量快速检测方法。HPV16/18型E6蛋白线性范围均为2.0-200 ng/m L;平均回收率分别为102.4%和98.1%;与鳞状细胞癌抗原(SCCa)、人附睾蛋白4(HE4)无明显交叉反应;试纸条批内CV均小于10%,批间CV均小于15%;通过临床实验,检测经临床病理确诊的宫颈癌患者样本46份、癌前病变CIN Ⅲ患者样本38份及HPV DNA阴性样本52份,结果显示用于筛查宫颈癌及癌前病变CIN Ⅲ敏感性分别为91.3%、84.2%,特异性达到100%。结论1.获得了纯度为95%的HPV18 E6重组蛋白。2.制备了一套用于HPV16/18型E6蛋白荧光免疫层析联合检测试纸条的室内参考品。3.建立了以管家蛋白β-Actin为内参的人宫颈上皮脱落细胞中HPV16/18型E6蛋白荧光免疫层析联合定量快速检测方法,为患者宫颈癌及癌前病变的早期筛查及辅助诊断提供了一种灵敏度高,特异性好,操作简便成本低廉的检测手段。