研究目的中东呼吸系统综合征冠状病毒（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV）于2012年在沙特阿拉伯发现,是一种能够引起人类死亡的冠状病毒,与SARS-CoV和SARS-CoV-2同属于Beta样冠状病毒。与其它冠状病毒相比,MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2的感染除了能够引起一般的乏力、发热、咳嗽、畏寒、肌痛等类似于感冒的症状外,部分患者会出现严重的器官衰竭如肺衰竭和肾衰竭以及严重的急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS）,而多器官衰竭和ARDS是诱发患者死亡的重要原因。SARS-CoV和SARS-CoV-2的致死率低于10%,而MERS-CoV感染有着高达36%以上的致死率。然而,目前仍然缺乏有效治疗MERS-CoV感染的药物和完善的治疗方案。因此,探究MERS-CoV感染引起宿主组织损伤的致病机理,可为开发针对MERS-CoV感染的治疗性药物提供理论基础,同时也对完善MERS-CoV感染的治疗方案具有重要的指导意义。现有的研究发现,病毒感染所引起的免疫系统失调、氧化应激、线粒体损伤和能量代谢异常等因素均能导致宿主的组织损伤和多器官衰竭,并且线粒体和氧化应激与免疫系统的活化之间也存在着重要联系。线粒体是细胞的能量中心,线粒体功能的正常发挥可以为细胞提供代谢所需要的能量。线粒体损伤一方面会引起细胞中过氧化物的释放、诱导细胞发生凋亡,同时释放出的DNA和ROS也会分别作为病原相关分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns,PAMPs）和损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns,DAMPs）激活细胞的NF-κB信号通路和炎症小体信号通路,诱发细胞产生强烈的炎症应答,导致器官衰竭的发生。目前对于MERS-CoV是否能够引起线粒体损伤尚不清楚。MERS-CoV是一种基因组长度约为30 knt的单股、正链RNA病毒,该基因组含有10个基因,编码11种蛋白质。其中,5’端orf1ab基因约占整个MERS-CoV基因组长度的三分之二,编码orf1a和orf1ab2种多聚蛋白,随后这2种多聚蛋白经MERS-CoV的木瓜样蛋白酶（papain-like protease,PLpro）nsp3 和 3C 样蛋白酶（3C-like protease,3CLpro）nsp5切割成16种非结构蛋白（nonstructural protein,nsp）。另外,3’端的剩余9个基因编码 4 种结构蛋白,M 蛋白（membrane protein）、N 蛋白（nucleocapsid protein）、S 蛋白（spikeprotein）和 E 蛋白（envelopeprotein）,以及 5 种辅助蛋白 ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5和ORF8b。然而,这些蛋白是否对线粒体造成损伤、影响细胞活力还不是很清楚。本研究构建了 MERS-CoV的orf1ab基因所编码的非结构蛋白过表达载体pCDH-nsp1～pCDH-nsp-16,并在细胞中进行过表达。首先,通过对细胞活力、周期以及迁移能力的检测,筛选出能够调控细胞活力的MERS-CoV病毒非结构蛋白-nsp1。然后,通过转录组测序、生物信息学分析以及分子生物学等手段探究MERS-CoV nsp1影响细胞活力的原因,深入研究、阐释其作用机制。最后,通过构建MERS-CoV nsp1转基因小鼠,进一步验证MERS-CoV nsp1对器官损伤的影响。该研究揭示了 MERS-CoV nsp1作为重要的毒力因子损伤宿主细胞活力的分子机制,为后续MERS-CoV治疗性药物开发提供靶点,并对MERS-CoV感染临床治疗方案的优化具有重要的指导意义。实验方法1.利用载体构建方法（限制性内切酶酶切与T4 DNA连接酶连接）构建了 MERS-CoV的orf1ab基因所编码的非结构蛋白表达载体pCDH-nsp1～pCDH-nsp16。在HEK293T细胞中过表达nsp1-nsp16,通过CCK8对细胞的活力进行检测,筛选出能够抑制细胞活力的MERS-CoV病毒非结构蛋白-nsp1。随后,将nsp1在A549细胞中进行过表达,并通过CCK8对A549细胞的活力进行检测,进一步验证nsp1对细胞的活力的影响。2.通过在引物上设计点突变位点,利用具备高保真特点的DNA聚合酶进行PCR扩增,构建nsp1的核酸内切酶活性位点突变体nsp1-CD（R146A、K147A）,并进一步通过CCK8检测nsp1-CD对细胞活力的影响,确定nsp1抑制细胞活力是否依赖于其核酸内切酶活性。3.将 pcDNA3.1、pcDNA3.1-nsp1 和 pcDNA3.1-nsp1-CD 分别转染到 HEK293T 和 A549细胞中,36h后,通过流式细胞术检测nsp1和nsp1-CD的表达对HEK293T和A549细胞周期的影响。4.将 pCDH、pCDH-nsp1 以及 pCDH-nsp1-CD 分别转染到 HEK293T 和 A549 细胞中,12h后,用枪头在细胞培养皿上进行划线,并记录此时的位置与划痕宽度,24h后再次进行拍照,记录此时的划痕宽度。运用ImageJ图像处理软件对细胞的迁移能力进行量化分析。5.转录组测序分析MERS-CoV nsp1/nsp1-CD对细胞基因谱的影响。将pCDH、pCDH-nsp1和pCDH-nsp1-CD分别在HEK293T细胞中过表达,36h后,倒掉培养基收取细胞,用预冷的PBS洗涤细胞2次。加入1 mL TRIzo1试剂,用液氮冰冻后通过干冰运输送至派森诺生物科技有限公司进行mRNA测序。6.生物信息学分析MERS-CoV nsp1/nsp1-CD对细胞功能相关基因的影响。将转录组测序的差异基因（上调/下调）分别进行KEGG和GO分析,寻找nsp1/nsp1-CD所影响的基因谱;进一步,利用KEGG和GO对分选获得的nsp1颗粒蛋白质谱结果进行分析。发现nsp1所影响的基因功能,探究nsp1的作用途径。7.将 pcDNA3.1、pcDNA3.1-nsp1和pcDNA3.1-nsp1-CD 分别转染到 HEK293T 细胞中,24h后,将细胞进行固定并制片,用透射电镜观察其对细胞中核糖体和线粒体的影响。8.将 pcDNA3.1、pcDNA3.1-nsp1和pcDNA3.1-nsp1-CD 过表达载体分别转染到 A549细胞中,36h后,进行Mito-Tracker-Red染色,并利用激光共聚焦显微镜观察nsp1和nsp1-CD对细胞中线粒体的影响。9.通过RT-qPCR检测细胞中核糖体蛋白基因（RPLP1、RPL19、RPS7、RPL36、RPL18、RPL10、RPS18、COX7C）、氧化磷酸化蛋白基因（ND UFA1、COX7C、COX5B、NDUFB7、ATP5F1E、COX4I1）、凋亡相关基因（BAD、BCL2L11、BIRC5）以及DPP4、AUP1、CHCHD2、C1QBP 的 mRNAs 水平。10.通过western blot检测HEK293T、A549细胞中nsp1和β-actin的蛋白质表达,nsp1颗粒分选前（pre-sorted）和分选后（sorted）样品中 nsp1、LSM14A、G3BP1、RPS18、COX4I1、LAMP1的蛋白质表达水平。11.将pCDH、pCDH-nsp1和pCDH-nsp1-CD过表达载体分别转染到A549细胞中,36h后,加入Janus green B进行染色,随后通过显微镜对细胞中的线粒体进行观察。12.将 pCDH、pCDH-nsp1 和 pCDH-nsp1-CD 分别转染到 HEK293T 和 A549 细胞中,通过Seahorse XF24细胞能量代谢分析仪检测HEK293T和A549细胞中氧化磷酸化水平的变化（OCR值）。13.将 pcDNA3.1、pcDNA3.1-nsp1 以及 pcDNA3.1-nsp1-CD 分别转染到 HEK293T 细胞中,36h后,通过JC-1线粒体膜电位检测试剂盒对细胞进行染色处理,随后,通过流式细胞术对线粒体膜电位的变化进行检测。14.将 pcDNA3.1-CHCHD2、pcDNA3.1-C1QBP 过表达载体分别与 pcDNA3.1、pcDNA3.1-nsp1 或 pcDNA3.1-nsp1-CD 进行共转染,36h 后,通过 RT-qPCR 检测细胞中核糖体蛋白基因（RPLP1、RPS18）和氧化磷酸化蛋白基因（COX7C、ND UFB7、ATP5F1E）的mRNA水平变化。15.将 pcDNA3.1、pcDNA3.1-nsp1 以及 pcDNA3.1-nsp1-CD 转染到 HEK293T 细胞中,12h后,加入放线菌素D（ActinomycinD,Act D）,对照组加入二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）,处理24h后,收取细胞并提取RNA,通过RT-qPCR检测核糖体蛋白基因RPS18和氧化磷酸化蛋白基因COX4I1的mRNA水平,确定nsp1是否影响这些基因的转录。16.利用XRN1-shRNA对HEK293T细胞中核酸外切酶XRN1基因的表达进行敲低,随后在XRN1 knockdown细胞与对照细胞中分别转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-nsp1和pcDNA3.1-nsp1-CD过表达载体;36h后,通过RT-qPCR检测细胞中核糖体蛋白基因RPS18和氧化磷酸化蛋白基因COX4I1的mRNA水平,确定nsp1是否通过XRN1对这些基因降解。17.将构建好的带有GFP标签的nsp1过表达载体pcDNA3.1-nsp1-GFP转染到HEK293T细胞中,24h后,收取细胞并按照nsp1-GFP颗粒分选步骤（详见正文“材料和方法”）进行nsp1颗粒分选。随后,nsp1颗粒分选前（pre-sorted）和分选后（sorted）的2种不同组分进行荧光显微镜观察和western b1ot检测,确定nsp1是否定位于已知细胞器。18.在HEK293T细胞中过表达pcDNA3.1-nsp1,24h后,使用nsp1单克隆抗体进行免疫荧光标记,随后,通过共聚焦显微镜观察nsp1在细胞中的定位情况;将pcDNA3.1-nsp1-GFP 与 pcDNA3.1-LSM14A-mCHerry、pcDNA3.1-G3BP1-mCherry 在 HEK293T细胞中进行共转,24h后,通过共聚焦显微镜观察nsp1与P小体（LSM14A）和应激颗粒（G3BP1）在细胞中的定位情况;将pcDNA3.1-nsp1-GFP在HEK293T细胞中进行过表达,24h后,用Mito-Tracker-Red和Lyso-Tracker-Red分别对线粒体和溶酶体进行标记,通过共聚焦显微镜观察nsp1与线粒体和溶酶体的共定位情况。19.将pCDH-nsp1转染到HEK293T细胞中,24h后,收取细胞并加入细胞裂解液;通过nsp1抗体与磁珠将nsp1、与nsp1发生相互作用的蛋白质进行共沉淀;利用蛋白质谱仪对nsp1抗体沉淀下来的蛋白质进行检测,并通过GO数据库对与nsp1相互作用的蛋白质进行富集分析。20.将pCDH-nsp1转染到HEK293T细胞中,24h后,收取细胞并加入含有RNA酶抑制剂（避免RNA降解）的裂解液;通过nsp1抗体与磁珠将nsp1、与nsp1发生相互作用的RNA进行共沉淀;通过TRizo1提取RNA,获得与nsp1发生相互作用的RNA,利用 RT-qPCR 检测 nsp1 降解的 mRNA（COX4I1、RPS18、ATP5F1E、CHCHD2、C1QBP）和非降解的mRNA（BAD、BCL2L11、BIRC5、nsp1）在nsp1颗粒中的含量。21.委托南方模式生物科技股份有限公司构建nsp1转基因小鼠（nsp1-tg）,nsp1基因之前的启动子选择四环素反应元件TRE,为此nsp1基因的表达可受四环素诱导。选取4-5周龄WT型和nsp1转基因阳性小鼠,分别进行正常喂养和四环素喂养（2mg/mL TeT）,共喂养2周,每天对小鼠体重进行记录;小鼠腹腔注射Poly（I:C）（2 μg/g体重）和D-氨基半乳糖（0.25 mg/g体重）,记录小鼠的生存情况。22.取上述正常喂养和四环素喂养的WT型、nsp1-tg小鼠的肺组织,利用TRizo1提取总RNA,通过RT-qPCR检测小鼠的肺组织中nsp1、Cox4i1、Rps18、Rplp1的mRNA水平。研究结果1.MERS-CoVnsp1能够显著抑制细胞的活力、周期和迁移能力通过在HEK293T细胞中分别过表达MERS-CoV的非结构蛋白并进行CCK8检测发现,MERS-CoV nsp1对HEK293T的细胞活力具有显著抑制作用,而其它非结构蛋白对细胞活力没有显著影响。进一步实验发现,MERS-CoV nsp1对HEK293T和A549的细胞活力抑制作用具有明显的剂量依赖性。同时,MERS-CoV nsp1能够将HEK293T和A549细胞的周期阻滞在G1期,并且显著抑制HEK293T和A549细胞的迁移能力。2.MERS-CoV nsp1对细胞活力的抑制依赖于其核酸内切酶活性由于MERS-CoV nsp1是一种核酸内切酶,为探究nsp1对于细胞活力的抑制是否依赖于其核酸内切酶活性,我们进一步构建了 MERS-CoV nsp1核酸内切酶活性位点突变体nsp1-CD,发现nsp1-CD对HEK293T和A549细胞的细胞活力、细胞周期以及迁移能力均没有显著影响,说明MERS-CoV nsp1抑制细胞活力依赖于其核酸内切酶活性。3.MERS-CoV nsp1下调核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNAs为进一步探究MERS-CoV nsp1抑制细胞活力的机制,我们通过转录组测序分析了MERS-CoV nsp 1/nsp 1-CD对细胞功能相关基因的影响。转录组测序结果与生物信息学分析发现,MERS-CoV nsp1能够特异性引起细胞中核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNAs 下调,而对其它生物过程的mRNAs水平变化没有显著影响。RT-qPCR结果显示,MERS-CoV nsp1能够特异性引起细胞中核糖体蛋白基因（RPLP1、RPL19、RPS7、RPL36、RPL18、RPL10）和氧化磷酸化蛋白基因（NDUFA1、COX7C、COX5B、NDUFB7）的mRNAs下调,而对MERS-CoV受体蛋白基因DPP4和脂质代谢相关基因AUP1的mRNA表达变化没有显著影响。此外,western blot检测结果也与转录组测序结果和RT-qPCR结果一致,并且MERS-CoV nsp1下调核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因mRNAs的作用依赖于其核酸内切酶活性位点。4.MERS-CoV nsp1引起核糖体数量减少并损伤线粒体由于MERS-CoV nsp1能够特异性下调核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNAs,进一步通过透射电镜对核糖体和线粒体检测,显示MERS-CoV nsp1能够引起细胞中核糖体数量的减少,并且引起细胞中线粒体发生损伤。通过对细胞线粒体活性的检测发现,MERS-CoV nsp1能够显著降低细胞中线粒体的活性与线粒体膜电位。对细胞线粒体氧化磷酸化过程的检测发现,MERS-CoV nsp1能够降低HEK293T细胞和A549细胞的基础呼吸值、ATP的产生和储备呼吸能力等。MERS-CoV nsp1引起的核糖体数量减少和线粒体功能损伤均依赖于其核酸内切酶活性。5.MERS-CoV nsp1直接降解核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNAs通过对MERS-CoV nsp1下调核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNAs机制研究发现,MERS-CoV nsp1下调这些基因的mRNAs不是通过调控C1QBP和CHCHD2等与氧化磷酸化蛋白基因转录相关蛋白的表达降低引起;同时,使用放线菌素D（Act D）抑制细胞中mRNA的转录、或敲低细胞中的核酸外切酶XRN1的表达,MERS-CoV nsp1依然能够下调核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNAs。这些结果说明,MERS-CoV nsp1是通过其核酸内切酶活性直接降解核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNAs,进而导致其下调。6.MERS-CoV nsp1定位的核糖核蛋白体复合物中富含nsp1所降解的mRNA通过激光共聚焦显微镜发现,MERS-CoV nsp1以一种液滴状颗粒分布于细胞中,并且不与细胞中的P小体（P-body）、应激颗粒（stressgranules,SGs）、线粒体、溶酶体等存在共定位。分选nsp1颗粒并进行质谱检测和生物信息学分析发现,MERS-CoV nsp1形成的颗粒是一种类似于P小体和SGs的核糖核蛋白体复合物。通过对P小体和SGs的转录组测序结果进行KEGG富集分析发现,P-body和SGs之外存在一种目前未知的核糖核蛋白体复合物,并且该复合物中富含核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNA。通过RIP实验发现,MERS-CoV nsp1存在的核糖核蛋白体复合物中也富含核糖体蛋白基因、氧化磷酸化蛋白基因以及C1QBP1和CHCHD2的mRNA,但是未检测到不受MERS-CoV nsp1影响的其它基因的mRNA。这些结果提示,MERS-CoV nsp1所定位的核糖核蛋白体复合物中富含nsp1所降解的mRNA,是导致这些基因mRNA降低的途径。7.MERS-CoV nsp1转基因小鼠更容易被poly（I:C）诱导而死亡体内实验结果显示,四环素喂养能够诱导MERS-CoV nsp1转基因小鼠中的nsp1表达。与WT型小鼠相比,nsp1的表达能够显著引起小鼠的体重下降。当小鼠用poly（I:C）诱导炎症性死亡时,MERS-CoV nsp1转基因小鼠更容易发生死亡。在对小鼠肺脏中核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNAs进行检测时也发现,MERS-CoV nsp1的表达显著降低小鼠肺脏中核糖体蛋白基因Rps18、Rplp1和氧化磷酸化蛋白基因Cox4i1的mRNA。结论1.本研究通过筛选发现MERS-CoV的非结构蛋白nsp1能够显著抑制细胞活力、迁移能力,并将细胞的周期阻滞在G1期,该作用依赖于其核酸内切酶活性。2.MERS-CoV nsp1能够引起细胞中的核糖体数量减少和线粒体损伤,抑制线粒体氧化磷酸化过程。3.MERS-CoV nsp1作为一种核酸内切酶,其抑制细胞活力主要是通过下调核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNAs,进而使细胞的蛋白质合成与能量代谢发生障碍。4.MERS-CoV nsp1定位于细胞中一种新的核糖核蛋白体复合物中,其中特异性富含核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNAs,进而有利于MERS-CoV nsp1对这些基因mRNA的降解。5.MERS-CoV nsp1能够引起小鼠体重降低,降低肺脏中核糖体蛋白基因和氧化磷酸化蛋白基因的mRNAs,并且对poly（I:C）诱导的炎性死亡更加敏感。意义本研究证明,MERS-CoV nsp1可以造成细胞核糖体数量减少、线粒体损伤进而引起细胞活力下降,并且nsp1的表达能够加剧小鼠由poly（I:C）诱导的炎性死亡,提示nsp1可能是MERS-CoV感染导致高致死率的重要毒力因子。此外,本研究发现nsp1定位于细胞中特异性富含核糖体蛋白基因与氧化磷酸化蛋白基因mRNAs的一种新的核糖核蛋白体复合物中,揭示了 MERS-CoV nsp1导致影响细胞活力的分子机制。本研究为后续冠状病毒的治疗性药物开发提供了新的潜在靶点和详实的实验依据,同时也为临床治疗方案的优化提供理论指导。