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本研究以番鸭为研究对象,通过对番鸭精原干细胞(SSCs)的分离培养、鉴定以及体外培养体系的筛选,以期为将来进行番鸭SSCs的长期培养与遗传操作提供基础资料。1.以28-30胚龄番鸭为试验材料,通过两步酶消化法结合差速贴壁法分离纯化睾丸单细胞悬液,通过形态学鉴定、AKP染色以及特异表达基因的检测证明分离出的单细胞悬液中存在SSCs。2.分别采用不同的饲养层及不同血清浓度体外培养SSCs,观察其增殖水平及克隆生成率。SSCs在均含10%FBS的明胶包被的无饲养层、成纤维细胞(DEF)饲养层、支持细胞(Sertoli细胞)饲养层的培养体系中培养6d的增殖率平均为106.62%、125.14%、126.87%,细胞克隆率平均为3.30%、27.80%、29.85%;在使用Sertoli细胞饲养层并分别加入0%、5%、10%、15%FBS的培养体系中培养6d的增殖率平均为26.29%、123.81%、126.73%、119.12%,细胞克隆率平均为0、30.78%、28.08%、25.08%。不同饲养层培养体系及血清含量不同的培养体系显著优于对照组(P<0.01)。培养于饲养层上,添加适当浓度血清的SSCs生长良好,增殖较快,并传至第三代。3.分别采用添加不同浓度的白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)以及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)四种细胞因子的培养体系体外培养SSCs。通过MTT法检测细胞因子浓度对SSCs体外增殖水平的影响。与对照组相比,添加不同浓度的四种细胞因子均能提高SSCs增殖水平,差异极显著(P<0.01)。LIF和SCF在低剂量时均表现为促进细胞增殖,高剂量时则抑制细胞增殖。通过方差分析推断LIF与SCF的最佳工作浓度分别为10-20ng/ml和20ng/ml。不同浓度bFGF对SSCs的增殖影响差异不显著。推断bFGF的最佳工作浓度为10-30ng/ml。在一定浓度范围内,SSCs的增殖水平随GDNF含量提高而提高。在体外培养体系中添加20-30ng/ml的GDNF时SSCs生长良好,增殖明显。综上所述,番鸭SSCs可通过两步酶消化法结合差速贴壁法能够获得;使用DEF或Sertoli细胞饲养层,并在体外培养体系中添加适当的血清以及细胞因子能有效促进SSCs的体外增殖。