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第一部分MicroRNA-22-3p在原发性卵巢功能不全患者血浆中显著下调及意义背景：长度为21-24核苷酸的非编码RNA被称为microRNA （miRNA）,广泛存在于人体各种组织和体液中,在转录后水平调控基因表达。大量研究证实miRNAs不仅可以作为诊断多种癌症、糖尿病等的有效标志物,在疾病发病过程中发挥重要作用；还可以影响生殖细胞增殖和凋亡,调控排卵及黄素化部分关键过程,参与卵巢功能的多个方面。目前关于niRNAs在POI疾病的研究较少,尚不能全面阐明niRNAs在POI患者中的变化及作用。目的：本研究旨在通过μParafloTM MicroRNA芯片技术筛选POI患者血浆中差异表达的miRNAs,并在较大样本人群中验证明确miRNAs在POI患者血浆中的表达谱及其临床作用。方法：募集2012年9月至2013年12月就诊于山东大学附属生殖医院的中国汉族POI患者140例、因男方因素或输卵管因素就诊的内分泌正常对照女性140例,留取新鲜血浆。首先通过μParafloTM MicroRNA芯片技术在10例POI患者和10例对照女性血浆中筛选差异表达的miRNAs,选择差异显著的miRNAs在260例独立样本中进行验证。结果：芯片筛选出差异表达miRNAs共51个,其中22个在POI患者血浆中上调,29个下调。选择表达丰度较高的9个差异表达miRNAs （let-7b-5p、let-7c、 miR-15b-5p、miR-22-3p、miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-151a-5p和miR-151b）在100例独立样本中验证,发现niR-22-3p在POI患者血浆中表达量下降,其余8个miRNAs在两组人群表达无显著差异。随后我们在160例样本中验证miR-22-3p,结果显示miR-22-3p在POI患者血浆中表达显著降低（差异倍数：0.74, P<0.05）; ROC （receiver operating characteristic）分析提示]miR-22-3p区分POI患者与对照人群的曲线下面积（Area Under Curve, AUC）为0.668；95%confidence interval （CI）:0.602-0.733;截断值（cut off value）为0.607,此截断值区分POI患者的敏感性和特异性分别是75.4%和54.6%。回归分析表明miR-22-3p是POI保护性因素（OR值：0.766,95%CI：0.643-0.912）,与血清FSH水平负相关（R2=0.687,P<0.05）。结论：本研究在POI患者血浆中筛选差异表达的miRNAs,发现miR-22-3p在POI患者表达量显著降低,与血清FSH水平负相关。提示miR-22-3p可能反映卵巢储备功能,是POI病理过程的一个结果。第二部分MicroRNA-379-5p调控PARP1、XRCC6在生化异常期原发性卵巢功能不全中的作用和机制研究背景：原发性卵巢功能不全病因高度异质,卵子发生障碍和卵泡耗竭加速是目前POI两种主要的致病机制假说。颗粒细胞是包绕卵母细胞的体细胞,与卵母细胞之间存在复杂的调控网络,大量研究指出颗粒细胞增殖、分化、侵袭等功能异常是卵巢卵泡耗竭的原因之一,而miRNAs可能在其中发挥重要作用。已有动物实验和体外实验表明miRNAs可以影响颗粒细胞增殖、凋亡及激素合成功能,但尚无POI患者颗粒细胞中miRNAs表达谱研究及功能研究。目的：本课题通过niRCURY?芯片技术筛选生化异常期POI患者颗粒细胞中差异表达的miRNAs;结合表达谱芯片结果,针对差异表达的miRNAs及其可能的靶基因进行功能实验,研究其对颗粒细胞生物学功能的影响和作用机制,从表观遗传角度探讨非编码RNA参与POI发生发展过程的分子机理。方法：募集2013年9月至2014年12月就诊于山东大学附属生殖医院的中国汉族生化异常阶段POI患者50例、因男方因素或输卵管因素就诊的内分泌正常对照女性50例,留取颗粒细胞。通过miRCURY?芯片技术筛选差异表达的miRNAs;与表达谱芯片联合分析选择差异最显著的miR-379-5p和其可能的靶基因PARP1、 XRCC6,通过Real-Time PCR在独立样本颗粒细胞中验证它们的表达趋势；在颗粒细胞系中过表达miR-379-5p,分别在未处理状态和紫外线（UV）和双氧水（H202）损伤后通过MTT、CCK8和EdU实验验证miR-379-5p对颗粒细胞增殖能力及损伤修复功能的影响；双荧光素酶报告系统实验等验证niR-379-5p对靶基因PARP1和XRCC6的调控及机制；沉默颗粒细胞中内源性PARP1和XRCC6,重复上述实验,明确miR-379-5p降调PARP1和XRCC6,对颗粒细胞增殖和DNA损伤修复功能的影响和作用机制。结果：芯片筛选出差异表达miRNAs共75条。我们对miRNA芯片和表达谱芯片结果进行联合分析,锁定miR-379-5p和它可能的靶基因PARPU XRCC60在60例独立样本中证实miR-379-5p在生化异常期POI患者颗粒细胞中显著上调,PARPU XRCC6在POI患者颗粒细胞中显著下调。过表达颗粒细胞中miR-379-5p可以显著抑制KGN细胞增殖,其增殖抑制作用呈时间依赖性；在UV/H2O2损伤后,过表达niR-379-5p组KGN细胞增殖抑制作用尤其显著。Luciferase和western blot实验证实miR-379-5p通过与PARPUXRCC6的3’UTR区域结合,降调PARPU XRCC6基因。特异性沉默内源性PARPU XRCC6基因对KGN细胞生物学行为可以产生与过表达miR-379-5p类似的作用,包括抑制KGN细胞增殖、UV/H2O2损伤后较低的细胞存活率和显著的增殖抑制作用等。结论：本研究首次发现POI患者颗粒细胞中显著上调的miR-379-5p可能通过降调PARPU XRCC6影响颗粒细胞增殖及损伤修复功能,参与POI疾病进程。第三部分长链非编码RNA在生化异常期原发性卵巢功能不全中的初步研究背景：长链非编码RNA （long noncoding RNA, IncRNA）是由RNA聚合酶Ⅱ转录形成、长度超过200nt的RNA分子,具有保守的剪接点和内含子,在组织和细胞中有特异的表达模式。LncRNAs可以参与染色体重塑、基因转录的激活和干扰、以及核内运输等重要调控过程,通过表观遗传沉默、转录和转录后水平调节等方式对基因表达进行调控,近年来,逐渐成为生物医学的研究热点。已有研究证实lncRNAs在癌症和神经系统疾病等人类重大疾病过程中发挥了重要的调控作用,但目前已经明确功能的lncRNAs仅有数十条,而在生殖系统疾病领域,尚无相关研究报道。目的：本研究通过芯片技术筛选并验证生化异常阶段POI患者颗粒细胞中差异表达的lncRNAs,初步探讨lncRNAs在POI患者颗粒细胞中的表达情况。方法：募集2013年9月至2014年12月就诊的中国汉族生化异常阶段POI患者50例、因男方因素或输卵管因素就诊的内分泌正常对照女性50例,留取颗粒细胞。通过LncRNA芯片技术在10例POI患者与10例对照女性颗粒细胞中筛选差异表达的lncRNAs和mRNAs;根据表达谱芯片Gene ontology和KEGG pathway分析结果,对差异表达的lncRNAs和mRNAs进行共表达网络分析（co-expression networks）,按照相对表达丰度、变化倍数及序列信息,选择处于核心位置、与重要且差异表达的基因存在相关关系的14条lncRNAs在60例独立样本中进行验证。结果：芯片结果发现差异表达lncRNAs序列677条。Real-Time PCR实验证实其中：TCONS 00010009、TCONS 00014547、NR 040662.1、ENST00000520306、ENST00000420313、ENST00000526225在POI患者颗粒细胞中显著下调。生物信息学分析表明它们全部属于lincRNAs,其周围均分布有许多功能重要的编码基因,尤其DNA损伤修复基因XRCC4和MSH5分别位于TCONS00010009和NR 040662附近不足300kb处,提示我们这些差异表达的lincRNAs可能通过调控周围的共表达基因参与POI疾病。结论：本研究首次通过Arraystar Human IncRNA芯片对颗粒细胞OncRNAs特征进行初步研究。生化异常阶段POI患者颗粒细胞中存在较多差异表达的LncRNA,可能与疾病相关。