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龙牙百合（Lilium brownii var.viridulum）是一种药食同源的天然保健品,经济价值很高,但存在严重的连作障碍。自毒作用是龙牙百合连作障碍的主要原因之一。在自毒物质胁迫下,龙牙百合基因表达调控系统如何变化以应对外界胁迫,至今尚无研究报道。本研究拟从龙牙百合植物组织和根系分泌物中分离鉴定自毒物质,测定和分析自毒物质的活性和对龙牙百合生理生化的影响,并借助转录组测序技术研究自毒物质胁迫下龙牙百合的分子机制,为治理龙牙百合连作障碍提供科学依据。主要研究结果如下:1、龙牙百合自毒物质的分离鉴定对龙牙百合水培溶液（根系分泌物）分别用石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取和对龙牙百合根、茎、鳞茎、叶（植物组织）进行固相微萃取,将上述所得样品用GC-MS（气质联用仪）鉴定。从根系分泌物的石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取液中分别检测出78、74、69种物质,其中有19种物质在三者中都被检测出,分别为苯乙酮、2-十四酮、pentadecan-3-one、正辛醛、反式-2-癸烯醛、庚醛、正己醛、壬醛、decylcyclopentane、3-甲基十五烷、正二十一烷、2,4,7,9-四甲基-5-癸炔-4,7-二醇、乙酸、二苯乙酮腙、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二乙酯;从植物组织根、茎、鳞茎和叶中分别检测出53、16、48和60种物质,四种组织共有的物质有三种,分别为十七烷、2,4-二叔丁基苯酚和2,4-二甲基苯甲醛。根据以上试验结果,从根系分泌物和植物组织中分别选择分离到的邻苯二甲酸二丁酯和2,4-二叔丁基苯酚这两种物质作为后续研究对象,而这两种物质已被前人在其它作物上鉴定为自毒物质。2、龙牙百合自毒物质活性测定对邻苯二甲酸二丁酯和2,4-二叔丁基苯酚两种物质进行自毒活性测定,分别用0、0.05、0.1、0.2、0.4和0.8 g/L溶液浓度的两种物质处理香葱种子,在第4d测发芽率,第5 d测根长和茎长。结果发现2,4-二叔丁基苯酚和邻苯二甲酸二丁酯对香葱种子的发芽及生长发育均具有抑制作用。2,4-二叔丁基苯酚和邻苯二甲酸二丁酯对香葱种子的发芽、根长和茎长的抑制率分别为51%、81%、79%和18%、29%、63%,随着浓度的增加,抑制作用增强,表明二者都具有化感自毒作用活性,且2,4-二叔丁基苯酚的自毒活性强于邻苯二甲酸二丁酯。3、自毒物质胁迫对龙牙百合生理生化的影响选取自毒活性较强的2,4-二叔丁基苯酚,分别以0、0.05、0.2和0.8 g/L处理龙牙百合,并在3、6、9、12、24、72、120和168 h取样,研究2,4-二叔丁基苯酚对龙牙百合超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和丙二醛（MDA）三个生理指标的影响。超氧物歧化酶（SOD）整体是一个比较平稳的趋势,且不同浓度处理后变化一致,先上升后下降（3 h-12 h）,再上升再下降（12 h-120 h）,最后上升;过氧化物酶（POD）,0.05 g/L浓度下其酶活比较平稳且一直保持在一个较低的水平;0.2 g/L在6 h后活性都显著低于CK;0.8 g/L变化与CK一致,在6 h之前显著低于CK,9-24 h与CK无显著差异;药物处理后MDA先下降,在9 h是达到最低,表明短时间的药物处理有助于龙牙百合生长,降低膜脂过氧化;之后快速上升在24 h达到最大,说明随时间的增加药物处理后植物生长受到抑制,发生膜脂过氧化,MDA大量积累。SOD、POD和MDA的变化说明2,4-二叔丁基苯酚能影响龙牙百合保护性酶的活性,体内外有害物质增加。表明龙牙百合在生长过程中体内（植物组织）和体外（根系分泌物）均有有毒物质的积累,使其生理生化发生异常,生长受阻。4、自毒物质胁迫下龙牙百合的转录组学分析依据生理生化试验结果,9、24和120 h是SOD、POD和MDA三个生理指标变化的时间点,且0.2 g/L和0.8 g/L浓度处理时酶活差异不显著,因此选择用0、0.05和0.8 g/L三个浓度的2,4-二叔丁基苯酚溶液处理水培龙牙百合,并分别在9、24和120 h取样进行转录组测序。对转录组测序结果进行生物学分析,一共获得188505个Unigene,用不同数据库对其进行基本注释,GO注释表明,共涉及53亚类,主要注释在细胞过程、代谢过程、细胞细胞器、催化活性等亚类中;KEGG注释结果中关于代谢的最多,23513个;KOG注释后可分为25类,其中一般功能预测的Unigene最多,12788个。并着重对CK1 vs H1,CK2 vs H2和CK3 vs H3的差异基因进行了分析。发现基因响应集中在细胞、细胞器、膜、催化活性、结合、应激反应、代谢过程等,同时也富集到一些特殊GO term,细胞壁生物合成（上调基因5个,下调基因15个）,植物激素相关基因（上调6个,下调15个）,细胞分裂（上调基因2个,下调基因10个）等,这些富集到的基因主要都是下调,使细胞壁结构受影响,激素分泌受影响,细胞分裂受损等,众多因素综合调控,植物生长受阻,从分子生物学上说明了龙牙百合具有自毒作用。5、转录组测序筛选自毒响应基因分析不同浓度处理组之间的基因表达量差异,筛选差异响应基因。共筛选到了43个可能的候选差异基因,这些基因主要与次生代谢产物、苯丙烷类生物合成等相关,而酚类代谢生成与这些通路密切相关,如4-香豆酸辅酶A连接酶lcs D（4-coumarate.Co A ligse,4CL,与多酚类化合物白藜芦醇的生成代谢相关）、肉桂酰辅酶A还原酶CCR1（cinnamoyl-Co A reductase,CCR,CCR的表达量会影响植物茎叶中的可溶性酚类物质的总含量）等。这些基因在龙牙百合2,4-二叔丁基苯酚自毒胁迫后产生差异,可能与龙牙百合的自毒作用相关。这些基因的筛选为今后龙牙百合自毒基因的定位、克隆、敲除等一系列基因工程奠定了基础。