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黏着斑激酶(FAK)是一种非受体型酪氨酸激酶,在细胞与细胞外基质相互作用中,通过激活一系列信号通路发挥调节细胞生长、迁移和生存的作用。尽管许多研究都表明,FAK在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用,但是关于FAK在肺癌中促生存、抗凋亡作用机制的研究还很少。
本实验应用光镜观察,Hoechst33342染核、Western Blot、RNA干涉技术等方法研究了FAK对肺癌细胞A549抗失巢凋亡的功能和信号传导通路。polyHEMA是研究失巢凋亡的常规试剂,它通过同性电荷相互排斥来抑制细胞贴壁,促使细胞悬浮生长。A549细胞悬浮培养24h时,经光镜和Hoechst33342染色可见细胞生长状态良好;当FAK被干涉时,Hoechst33342染色出现明显的细胞凋亡现象。用Western blot检测干涉组和对照组,磷酸化SRC、PI3K、ERK、P38(而不是JNK)、CASPASE3的表达水平也明显下降;细胞色素C(CYC)的表达水平增加。为了进一步了解FAK在A549肺癌细胞中抗失巢凋亡的机制,检测了FAK的磷酸化位点和下游信号分子SRC、PI3K/AKT、ERK、JNK、P38的磷酸化水平和CYC、CASPASE3的表达情况。Western Blot结果表明,悬浮不同时间,FAK的Tyr397、Tyr861、Tyr925位点的磷酸化水平随时间变化逐渐升高后降低;FAK下游信号SRC、PI3K/AKT、ERK、P38的磷酸化水平也随时间变化明显升高又降低;CYC、CASPASE3的表达没有明显变化。最后,SRC、MEK1和PI3K的特异抑制剂PP2、PD98059和LY294002分别作用于A549细胞,证实SRC、PI3K和ERK在调节细胞抗失巢凋亡中发挥重要作用。
研究结果表明:FAK的过表达在肺癌细胞抗失巢凋亡中发挥重要作用。且与细胞外基质分离时,FAK可能通过Tyr397、Tyr861和Tyrp925位点的磷酸化,激活FAK-Tyr397-SRC-Tyr925-PI3K-AKT或FAK-TVr397-PI3K-AKT或FAK-MAPK-ERK途径促进肺癌的抗失巢凋亡的功能;可能FAK-MAPK-P38途径也发挥了抗失巢凋亡的功能。