目前为止,肺癌治疗取得了一些进步,但是肺癌仍是目前发病率最高的恶性肿瘤,特别是中晚期肺癌预后差,传统放化疗方案不敏感抑或容易发生肿瘤耐药,因此,开发新的肺癌治疗策略依然是我们面临的任务。天然产物是抗癌剂开发的重要来源,如从紫杉树皮提取的紫杉醇和从长春花中提取的长春新碱均已被广泛应用于临床肿瘤治疗。血根碱(Sanguinarine,SAN)是一种来自中药博落回或白屈菜的生物碱。以往的研究表明血根碱具有抗菌、抗炎等多种生物学活性。近来研究结果显示血根碱对前列腺癌、骨肉瘤、乳腺癌等具有抗肿瘤作用。提示该化合物可能应用于肺癌的治疗,但是,其抗肿瘤作用机制尚需要进一步明确。癌细胞由于快速代谢和生长的需要,通常表现出内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)、有丝分裂应激(Mitotic stress)、代谢应激(Metabolic stress)及氧化应激(Reactive oxygen species,ROS)等细胞内一系列适应性反应。目前认为,内质网应激等具有促存活、促死亡的双重作用。一方面肿瘤细胞往往依赖于应激相关反应的调控蛋白来支持自身的生存;而另一方面某些药物比如紫杉醇、5-氟尿嘧啶、硼替佐米等化疗药物可以通过诱导过度的内质网应激发挥其促凋亡作用,从而发挥抗肿瘤作用。活性氧簇(Oxidative Stress,OS)作为信号分子多方面参与了某些细胞功能的调控与执行,在决定细胞命运中发挥了关键的作用。ROS可能成为肿瘤治疗的潜在靶点,人们试图通过增加ROS的生成达到治疗肿瘤的目的。同时,多个研究指出ROS可以增强内质网应激,从而导致细胞死亡。内质网应激与ROS可以互为因果关系。因此,ROS的产生和内质网应激在细胞死亡中的作用引起了广泛关注。本论文观察血根碱对肺腺癌细胞的生长抑制作用,通过检测ROS的产生与内质网应激信号途径相关蛋白的表达,分析内质网应激与ROS的交互调节作用,探讨血根碱抑制肺腺癌细胞生长机制,及为抗肿瘤药物的开发提供理论与实验依据。方法(1)收集肺腺癌组织病理标本,免疫组化染色检查GRP78、CHOP蛋白表达。(2)人肺腺癌细胞株spc-a1从中国科学院获得。利用mtt法分析血根碱对人肺腺癌细胞株spc-a1的存活率的影响;hoechst33258染色、激光共聚焦显微镜观察细胞核染色质的形态学改变;westernblot法检测bax、cleaved-caspase-3、p-parp-1等凋亡、应激相关蛋白的表达。(3)cm-h2dcfda染色并利用激光扫描共聚焦显微镜观察血根碱处理后spc-a1细胞内的ros水平;观察抗氧化物n-乙酰半胱氨酸(nac)对血根碱抑制spc-a1细胞增殖作用及血根碱诱导细胞凋亡作用的影响。(4)采用rt-pcr法分析与未折叠蛋白积累相关的84个关键基因的表达,基因的表达变化以热图形式显示;westernblot法检测grp78、p-perk、p-eif2α、atf-4、chop等凋亡、内质网应激相关蛋白的表达;mtt法与hoechst33258染色法,观察内质网应激抑制剂tudca对血根碱抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡作用的影响。(5)cm-h2dcfda染色观察tudca联合血根碱作用后spc-a1细胞中ros水平的变化;westernblot法分析nac联合血根碱对细胞中grp78、chop蛋白表达的影响。(6)各组数据均值采用x2±sd表示,统计学处理采用spss11.5软件分析。结果1.肺腺癌组织病理标本内质网应激相关蛋白grp78、chop的表达。我们对来自肺癌患者,并经病理学医生确诊的人肺腺癌组织进行免疫组织化学染色。grp78阳性部位定位于细胞胞浆,而chop阳性表达除了胞浆外,在胞核内也出现黄色或棕黄色颗粒。而在癌旁组织只见肺泡巨噬细胞胞浆内棕黄色染色,而在其他细胞内未见明显的变化。提示grp78与chop等内质网应激相关蛋白表达的平衡与人肺腺癌的发生发展有关。2.血根碱抑制人肺腺癌细胞株spc-a1的增殖,诱导细胞发生凋亡。为了测定血根碱对人肺腺癌细胞株spc-a1生长的抑制作用,我们采用不同剂量的血根碱(0.5、1、2和4μm))处理细胞24小时。利用mtt法分析其细胞存活率。结果显示,血根碱可以抑制细胞生长并呈现剂量依赖性。利用hoechst33258染色观察细胞凋亡的变化,发现分别用0.5、1、2和4μm血根碱处理细胞24小时后,人肺腺癌细胞株spc-a1的细胞核发生染色质浓聚、核碎裂等明显的凋亡改变,提示血根碱可通过诱导细胞发生凋亡发挥其抗癌活性。3.血根碱诱导人肺腺癌细胞株spc-a1产生ros应用血根碱(1、2μm)处理细胞24小时后,应用cm-h2dcfda染色和激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内ros的水平。结果表明,随着血根碱浓度的增高,细胞内的ros均显著增高,并呈现剂量依赖性的特点。将spc-a1细胞采用100μmn-乙酰半胱氨酸(nac)预处理1小时,能显著抑制血根碱诱导的细胞生长抑制,同时也减少了血根碱诱导的细胞凋亡。这些结果表明,血根碱介导的生长抑制与凋亡部分依赖于ros的产生。因此,ros的产生与血根碱诱导细胞发生凋亡密切相关。4.血根碱诱导的内质网应激参与了凋亡我们使用rt-pcr检测与内质网应激、未折叠蛋白反应信号通路相关基因表达的变化。检测结果发现,血根碱(2μm,24h)处理spc-a1细胞后,32个基因表达上调2倍以上,包括葡萄糖调节蛋白78(grp78),α需肌醇激酶1(ire1αern1),激活转录因子6(atf6α),激活转录因子4(atf4),生长抑制和dna损伤诱导基因34(gadd34,ppp1r15a)和caat/增强子结合蛋白同源蛋白(chop,ddit3)。进一步应用western印迹法检测蛋白的表达,实验证实:血根碱以剂量依赖的方式增加grp78、磷酸化蛋白激酶r(pkr)样内质网激酶(perk),p-eukaryotic翻译起始因子2(p-eif2α),atf4和chop蛋白的表达。因此,血根碱可以诱导spc-a1细胞发生内质网应激。内质网应激被认为在与细胞死亡相关的病理生理过程中发挥着重要的作用。为了进一步确认内质网应激对血根碱诱导的生长抑制的影响,我们采用内质网应激阻断剂tudca预处理细胞(50μm,1h),mtt法检测细胞存活率,hoechst33258染色观察细胞凋亡。mtt法与hoechst染色法结果表明,tudca可部分逆转血根碱诱导的细胞生长抑制。实验结果表明,内质网应激与血根碱诱导的spc-a1细胞的生长抑制和凋亡具有相关性。5.内质网应激与ros在肺癌细胞存活与凋亡过程中的关系ros引起氧化应激,导致内质网应激通过未折叠蛋白和/或错误折叠蛋白的积聚激活未折叠蛋白反应,其中涉及多种分子。我们同时也在探讨内质网应激与ros之间的关系,确定内质网应激是否参与调节ros的产生。结果发现:用50μm内质网应激阻断剂tudca预处理spc-a1细胞1小时,然后继续加入血根碱2μm处理细胞24h,与单独加入血根碱组比较有部分逆转血根碱诱导产生ros的现象。同时,用ros阻断剂nac预处理spc-a1细胞(100μm,1h),然后继续加入血根碱处理细胞(2μm,24h),内质网应激相关蛋白grp78和chop的表达较单独加入血根碱组明显减弱。这些数据表明,药物阻断内质网应激能降低ros的产生,而nac清除ros可以减轻内质网应激。因此,内质网应激和ros的产生相互促进,形成恶性循环。结论1.人肺腺癌组织高表达grp78与chop等内质网应激相关蛋白与肿瘤周围的癌旁组织相比,grp78阳性部位定位于细胞胞浆,而chop阳性表达除了胞浆外,在胞核内也出现黄色或棕黄色颗粒。表明内质网应激的状态与人肺腺癌的发生发展有关。2.血根碱通过诱导细胞凋亡抑制人肺腺癌细胞株spc-a1的增殖血根碱降低细胞活力,并呈剂量依赖性。hoechst染色结果显示,随着血根碱剂量增加,细胞凋亡率显著升高。3.ros参与了血根碱诱导的细胞生长抑制和凋亡血根碱能够剂量依赖性地增加ros的产生;抗氧化剂nac通过抑制血根碱诱导的肺腺癌细胞的凋亡,进一步确认血根碱诱导细胞凋亡与其氧化应激作用密切相关。4.血根碱通过内质网应激途径诱导人肺腺癌细胞凋亡内质网应激途径相关分子pcr-array方法与免疫印记的方法结果显示:血根碱能够增加grp78,p-perk,ire1a和atf6a等内质网应激相关的分子mrna与蛋白的表达。内质网应激抑制剂tudca减弱了血根碱诱导的细胞生长抑制和凋亡。提示血根碱激活了人肺腺癌细胞内质网应激。5.氧化应激与内质网应激的交互作用是血根碱抗肿瘤作用的主要机制我们分别采用ros清除剂nac与内质网应激阻断剂tudca,发现血根碱诱导的内质网应激能够增强ros的产生;反过来,血根碱诱导的ros也能诱导内质网应激的发生。因此,氧化应激与内质网应激之间形成的恶性反馈循环可能是血根碱抑制肺癌细胞增殖的主要机制之一。