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腺样囊性癌(Adenoid cystic carcinoma, ACC)占涎腺恶性肿瘤约27%,粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)占涎腺恶性肿瘤约30%,治疗方法以外科手术为主,晚期及有广泛侵袭转移的病例需要采用放射治疗或药物治疗,然而癌细胞的多药耐药性使药物治疗难以获得理想的效果。多药耐药(MDR,Multidrug resistance)是指由于长期使用一种药物而产生的对多种药物耐药的特性。目前研究最广泛的耐药机制是细胞将药物泵出的膜转运蛋白。p-糖蛋白(P-gp,p-glycoprotein)、多药耐药相关蛋白(MRP,Multidrug resistance-associated protein)是与耐药相关的两个主要蛋白。我们在前期的研究中建立了ACC和MC3的耐药细胞系ACC-2/BLM和MC3/5-FU,发现耐药细胞中编码MRP1蛋白的基因ABCC1基因(又称MRP1基因)在ACC-2/BLM高表达,本研究发现ABCC1在MC3/5-FU细胞中也高表达,用RNAi技术沉默ABCC1基因后,耐药细胞的耐药性被逆转,说明ABCC1可能在ACC和MC3的耐药中都发挥着重要作用,同时也说明用RNAi技术可以逆转腺样囊性癌和粘液表皮样癌细胞的耐药性。研究内容1.运用体外药物诱导和裸鼠体内移植瘤模型诱导相结合的方法,维持和提高ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞的耐药性。2.应用Agilent人类全基因4*44K芯片检测ACC-2与ACC-2/BLM细胞以及MC3与MC3/5-FU细胞表达差异基因,对基因芯片检测获得的数据用National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), NIH提供的DAVID Bioinformatics Resources 6.7软件进行分析(网址http://david. abcc.ncifcrf.gov/)。对丰度记分(Enrichment Score,ES)大于1的基因进行差异表达基因的功能分类(“GO”分析)。3.用RT-PCR验证分析两组细胞部分共同差异表达的基因,确定ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞共同表达的耐药基因。4.用Lipofectamine 2000将本课题组前期实验中设计构建的真核表达载体(包括含有针对ABCC1基因的4个不同shRNA片段)pGPU6/GFP/ Neo-ABCC1 shRNA转染ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞,通过RT-PCR分别检测转染72h后ABCC1基因沉默情况,选出效率最高的shRNA,挑出转染该片段的单克隆细胞,扩大培养,检测其mRNA和蛋白质的表达下降情况,并检测其耐药性的改变。实验结果1、维持和提高了ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞的耐药性,两株细胞已在体外维持培养均超过1年,经过1年体外、体内的维持诱导,BLM对ACC-2细胞对BLM、5-FU、CDDP、CTX、VCR的耐药性分别提高了33.3%、29.7%、5.3%、14.7%、10.0%; MC3/5-FU细胞对5-FU、BLM、VCR、VBL和CDDP的耐药性分别提高了171.5%%、73.1%、41.2%、20.1%和634.0%2、用包括45,015个基因的表达谱芯片检测,ACC-2/BLM和ACC-2相比较表达上调基因(Ratio>2.5)514个;表达下调基因(Ratio<0.4)466个;MC/5-FU与MC细胞相比较表达上调基因(Ratio>2.5)198个;表达下调基因(Ratio<0.4)384个。并对丰度记分(Enrichment Score,ES)大于1的基因进行差异表达基因的功能分类(“GO”分析)。耐药细胞中高表达的基因大致包括生长因子、细胞外基质等基因。耐药细胞中低表达的基因大致包括细胞对药物或内外、外界刺激反应、细胞凋亡等基因。3、对7个基因的表达用RT-PCR方法进行了验证,结果与基因芯片检测趋势一致,但有差别。基因芯片检测结果按照“差异基因筛选标准为ratio>2.0为上调基因,ratio<0.5为下调基因”的原则,CA9和TGM2在两个耐药细胞系中高表达,AIF、CXCR4、P53在ACC-2/BLM细胞中低表达,在MC3/5-FU细胞中表达与MC3无差异。HIF1在两对耐药细胞和亲本细胞中表达无差异。ABCC1在ACC-2/BLM中高表达,在MC3/5-FU和MC3细胞中表达无差异。RT-PCR检测结果两个耐药细胞系共同高表达CA9、CXCR4、HIF1和ABCC1,共同低表达TGM2、AIF和P53。4、运用本课题组前期实验中设计构建的真核表达载体(包括含有针对ABCC1基因的4个不同shRNA片段)pGPU6/GFP/Neo-ABCC1分别转染ACC-2/BLM细胞和MC3/5-FU细胞,对ACC-2/BLM细胞转染效率约为40-50%,对MC3/5-FU细胞细胞转染效率约为30%。RealTime-PCR结果显示,转染第4个shRNA片段的细胞,ABCC1 mRNA在72h时表达水平明显下降,挑出其单克隆进行细胞扩大培养,蛋白表达明显下降,克隆形成率明显下降。被转染的ACC-2/BLM细胞对BLM、5-FU、CDDP、CTX、VCR的耐药性逆转率(%)分别为92.55、63.48、50.42、11.38、81.13;裸鼠体内耐药性逆转率为43.8%。被转染的MC3/5-FU细胞对对CTX、VCR、BLM、CDDP、5-FU耐药性逆转率(%)分别为34.7、16.4、30.1、69.9、97.9;裸鼠体内耐药性逆转率为42%。结论1、体内外诱导法提高了ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞的多药耐药性。2、ACC-2/BLM产生多药耐药性与众多基因相关。3、ABCC1基因可能是ACC-2/BLM细胞系产生多药耐药性的主要相关基因。4、用RNAi技术沉默ABCC1基因可以逆转ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞的耐药性,对不同药物的耐药性逆转率不同。