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鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)是一种感染4-21日龄雏鹅和雏番鸭的单链线性DNA病毒,新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)是引起鸭短喙-侏儒综合征的病原,NGPV在遗传性和抗原性方面与GPV极其相似,近年来流行病学调查显示在商业化的鸭群中GPV可与其他病原协同存在或感染发病,文献报道GPV人工感染雏鸭可造成雏鸭不同脏器的损伤,但没有直接证据证实GPV在鸭群的传播,GPV对鸭免疫器官的损伤情况也未见报道。本研究通过对2015-2018年安徽地区GPV的分离鉴定,扩增其VP基因,绘制遗传进化树,选择与NGPV亲缘关系最近的一株经典GPV AH-1株进行雏鸭攻毒试验,观察GPV对雏鸭免疫器官的损伤,旨在研究GPV在雏鸭免疫器官内的增殖规律,为揭示GPV的致病机制提供参考依据。1、对2015-2018年安徽地区12例具有典型临床症状的疑似GPV病例和2例疑似NGPV病例的组织进行PCR检测,检测结果显示均为阳性,其中GPV命名为AH-1至12,NGPV命名为AH13和AH14。然后,将14份病料分别接种13日龄非免疫鹅胚,结果胚体、脏器均出现不同程度的出血;收集死亡胚体尿囊液,扩增14株病料VP基因和ITR基因,并测序进行遗传进化分析,结果显示12株GPV属于一个子集,亲缘性较高,其中GPVAH-1株(GenBank登录号:MK333463)与NGPV具有很高的同源性,因此,选择GPV AH-1株进行鹅胚半数致死量测定,结果显示AH-1株的ELD50=10-4.17/0.2ml,并以此毒株作为后续研究的候选株。2、参考GPV标准B株基因(GenBank登录号:U25749)VP3片段设计一对特异性引物,扩增VP3基因,测序正确后构建pMD18-T-VP3质粒,以该质粒为阳性标准品,建立了 SYBR Green I荧光定量PCR方法。VP3标准曲线的线性回归方程为:y=-3.2568X+37.987(R2=0.9986),扩增效率在90%-120%之间,最低检测下限为46.95copies/μL,这说明建立的SYBR Green I荧光定量PCR的反应有效性以及不同浓度梯度对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系。特异性试验中DTMUV、GPMV、ALV、ILTV、CIAV均为阴性,应用SYBR Green I荧光定量PCR方法检测GPV在雏鹅组织内的病毒含量变化,结果显示在感染后3-5d内均能在组织中检测到病毒,表明该方法具有很高灵敏度和特异性。3、用1000倍ELD50的GPVAH-1株肌肉注射2日龄非免疫雏鸭,研究GPV对雏鸭免疫器官的病理损伤。通过人工感染雏鸭,采集攻毒后1d、3d、5d、7d、10d、14d 7个时间段的组织分别进行大体检查、病理切片观察,抗原的定量和定位分析,结果显示GPV感染雏鸭后除了感染后1d有轻微的精神沉郁和厌食外,无异常变化,14d内没有死亡,感染后3d胸腺有出血点,5d脾脏与肠管肿大,7d肝脏有点状出血。镜下观察感染后5-7d胸腺和脾脏出血较严重,3-5d哈德氏腺充血较为严重,10-14d后所有脏器损伤减轻或消失。qPCR检测结果显示病毒在法氏囊、胸腺、哈德氏腺中第一天增殖达到最高水平并随后呈现递减的规律;在脾脏、盲肠扁桃、骨髓细胞中的增殖规律呈现先增后减的趋势。抗原定位结果显示GPV在免疫器官中3-5d内阳性信号较强,7d后阳性信号逐渐减弱,这些结果说明GPV能够在鸭体免疫器官复制,并造成部分免疫器官病理损伤。综上所述,本研究对12例安徽地区GPV和2例NGPV进行了分离鉴定和VP基因的扩增分析;建立了检测GPV的SYBR Green I荧光定量PCR方法;选取一株GPV经典强毒株AH-1通过肌肉注射雏鸭,观察GPV对雏鸭的病理损伤,并对1-14d感染雏鸭的各免疫器官进行了 GPV的定量和定位分析,为研究GPV的致病机制提供了一定参考依据。