论文部分内容阅读
目的：乙型肝炎病毒(HBV)的持续感染是当前严重的全球健康问题之一，也是导致慢性肝病最常见的原因。由HBV持续感染所引起的病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等己成为严重危害人类健康的疾病。核苷类似物拉米夫定可有效抑制病毒的复制，但长期应用可产生拉米夫定耐药变异株。拉米夫定耐药变异株的出现严重阻碍了乙肝的有效治疗，与其相关研究备受关注。研究表明RNAi己在很多领域显示出对目的基因的清除作用，因此，RNAi也成为治疗HBV感染的一种可选的重要手段。其中等位基因RNAi(allele-specific RNAi:ASP-RNAi)技术是RNAi特异性沉默等位基因的进一步应用，该技术可以在有效抑制变异型基因表达的同时而不破坏野生型基因的表达。因此本研究将ASP-RNAi技术应用在抗HBV拉米夫定耐药问题上，体外观察其对HBV拉米夫定耐药变异株DNA复制与抗原表达的影响。为从分子水平深入探讨HBV的耐药机制，以寻求对核苷类似物耐药HBV的有效治疗药物，为临床解决耐药HBV的抗病毒治疗提供新途径和实验依据。
方法：1.采用PCR、酶切、基因测序的方法对HBV拉米夫定耐药变异株（HepG2-HBV-YIDD）与野毒株(HepG2-HBV-WT)稳定表达细胞系内HBV拉米夫定耐药变异位点做鉴定；同时采用ELISA、Real-time PCR的方法评测细胞外HBsAg和HBeAg的表达及细胞内HBV DNA复制的稳定性。2.针对拉米夫定耐药型HBV rtM2041变异位点，根据ASP-RNAi的原理，采用单碱基错配的方式设计19个siRNA，并将其与拉米夫定联合应用于HepG2-HBV-YIDD与HepG2-HBV-WT全基因真核表达系统中，通过ELISA、Real-time PCR等方法筛选出能够同时抑制拉米夫定耐药株与野毒株的最有效siRNA，以及能够有效鉴别二者的siRNA，并分析其与拉米夫定联合应用后对HBV抑制效果的变化。3.针对siRNA P3位点单碱基错配设计P3-YIDD与P3-WT，并将其应用于HepG2-HBV-YIDD与HepG2-HBV-WT全基因真核表达系统中，通过ELISA、Real-time PCR的方法，分析并阐述两个siRNA对HBV-YIDD与HBV-T的鉴别性抑制效果。
结果：1.经测序鉴定，HepG2-HBV-YIDD细胞中HBV基因组中P区发生rtM204I伴随rtL801/V的变异，同时还伴随BCP/PC区的A1762T/G1764A和G1896A的变异。2.经ELISA检测HepG2-HBV-WT、HepG2-HBV-YIDD细胞培养上清中的HBsAg表达均为阳性；HepG2-HBV-WT细胞培养上清中的HBeAg表达为阳性；两细胞内HBV DNA含量均为阳性。3.当19个siRNA单独作用于HepG2-HBV-WT、HepG2-HBV-YIDD细胞72小时后，其中P7可同时对HepG2-HBV-YIDD与HepG2-HBV-WT两细胞内DNA的复制产生显著的抑制作用，其抑制率分别为77.23％和88.8％，与无关siRNA对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05); P7在96小时对两种细胞上清中的HBsAg表达也同时产生很强的抑制作用，其抑制率分别为77.69％和79.07％;各组siRNA对两细胞上清中HBeAg表达的抑制率随时间变化不明显，均低于20％，且与无关siRNA对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。4.当19个siRNA分别与拉米夫定联合应用于HepG2-HBV-WT、HepG2-HBV-YIDD细胞72小时后，其中P18在与拉米夫定联合应用后对HBV-YIDD DNA复制产生的抑制作用最强，其抑制率为86.99％，与无关siRNA对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)，但其对HBV-WT DNA复制产生的抑制率仅为21.01％。5.当P3-YIDD和P3-WT作用于两细胞72小时后，二者对HepG2-HBV-YIDD细胞内HBV DNA复制的抑制率分别为45.8％和2.11％；作用96小时后，对HepG2-HBV-YIDD细胞上清中HBsAg表达的抑制率分别为53.84％和11.27％，而对HepG2-HBV-WT细胞上清中HBsAg表达的抑制率分别为10％和49.24％，二者之间的显著性差异具有统计学意义(P<0.05): P3-YIDD和P3-WT对HepG2-HBV-WT细胞上清中HBeAg表达的抑制率分别为12.79％和14.85％，二者之间的差异无统计学意义(P>0.05)。
结论：综上所述，HepG2-HBV-YIDD与HepG2-HBV-WT真核表达系统为研究HBV拉米夫定耐药问题提供了一个良好的体外细胞模型；单独应用19个siRNA作用于两种细胞后，其中P7能够同时对HBV-YIDD和HBV-WT产生显著的抑制作用；当19个siRNA分别与拉米夫定联合应用于两种细胞后，其中P18对HBV-YIDD DNA复制产生的抑制作用最强；P3位点在目标mRNA的剪切过程中起着极为重要的生化作用，针对该位点设计的P3-YIDD与P3-WT是一对具有鉴别性抑制HBV-YIDD与HBV-WT两病毒株的siRNA，以上结论为RNAi技术在研究HBV拉米夫定耐药问题上及诊断HBV的耐药性方面开辟了崭新的思路和方法。