论文部分内容阅读
目的：多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）是一种起源于骨髓终末期B细胞的恶性克隆性疾病，约占血液系统恶性疾病的10％，多发生于60岁以上的老年患者，化疗耐受力差。目前常用的化疗方案有MP (马法兰+强的松)、VAD(长春新碱、阿霉素及地塞米松)等，治疗有效率约70%，但完全缓解率只有3-10%，中位总生存期仅3年左右。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib, BTZ)的应用改善了患者的预后，但约30%的患者硼替佐米治疗无效。提高硼替佐米的剂量可以提高疗效，但可引起严重的副作用尤其是周围神经病变限制了其临床应用。去甲斑蝥素（Norcantharidin, NCTD）是传统肿瘤中药斑蝥去除1.2位的两个甲基合成，对多种肿瘤细胞系，特别是消化系统肿瘤，有显著的抗癌活性。我们的前期工作证实，去甲斑蝥素通过诱导细胞凋亡发挥抗骨髓瘤效应，并能增强阿霉素的抗肿瘤效应。本实验旨在通过观察去甲斑蝥素联合硼替佐米对骨髓瘤细胞增殖、凋亡以及核因子-κB(NF-κB)信号通路相关基因及蛋白的影响，并观察其对荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用，初步探讨其作用机理，为临床治疗多发性骨髓瘤提供新的思路。方法:1MTT（四甲基偶氮唑盐比色）法检测NCTD，BTZ单独或联合对U266细胞增殖的影响；等效应曲线法计算NCTD和BTZ联合的CI值，并绘制等效曲线：1.1NCTD和BTZ对U266细胞的增殖抑制作用：对人MM细胞株U266进行常规培养，应用不同浓度的NCTD（0、1.25、2.5、5、10、20μmol/L）和BTZ（0、1.25、2.5、5、10、20nmol/L）作用于U266细胞72h后，MTT法检测其对U266细胞的生长抑制作用，并计算半数抑制浓度(50%inhibiting concentration, IC50)。1.2NCTD对BTZ的化疗增敏作用：将NCTD和BTZ按1000:1的比例共同作用于U266细胞72h后，MTT法检测细胞活性，等效应曲线法计算NCTD和BTZ联合的CI值，并绘制等效曲线。2实验分组：实验分为对照组、NCTD组（5μmol/L），BTZ组（5nmol/L）以及联合组（5μmol/L NCTD+5nmol/L BTZ）。3流式细胞术(FCM)分析凋亡细胞和细胞周期；Western blot法检测用药前后多聚ADP-核糖聚合酶（PolyADP ribose polymerase, PARP）和裂解的PARP（Cleaved PARP）的变化。4采用RT-q PCR方法检测核因子-κB P65(NF-κB P65)、Survivin、Bcl-2和Bax mRNA的表达。5应用Western blot法检测核因子-κB P65(NF-κB P65)、磷酸化NF-κBP65(p-NF-κB P65)、NF-κB抑制因子IκBα、磷酸化IκBα (p-IκBα)、Survivin、Bcl-2和Bax蛋白的表达变化；6建立人骨髓瘤荷瘤裸鼠动物模型，分别给予NCTD（20mg/kg，3次/周，共4周）、BTZ (0.25mg/kg，1/周，共4周)和二者联合（NCTD20mg/kg，3次/周；BTZ0.25mg/kg，1/周，共4周)，测定裸鼠移植瘤瘤体积改变，并绘制生长曲线。结果:1NCTD和BTZ均能抑制U266细胞的增殖，在一定浓度范围内，抑制率随药物浓度的增加而增加，呈现出剂量效应关系。而两药联合应用能够更加明显抑制肿瘤细胞增殖。2.5μmol/L的NCTD与2.5nmol/L的BTZ单独应用时的抑制率分别为(10.50±2.40)%和(17.50±1.40)%，而二者联合后抑制率达到(68.10±2.00)%。在实验浓度内，CI值均小于1，说明两药具有协同作用。2联合组相比BTZ单用组，细胞凋亡率明显增加：对照组、 BTZ组(5nmol/L)、NCTD组(5μmol/L)以及联合组(5μmol/LNCTD+5nmol/L BTZ)的凋亡率分别为：(5.28±1.19)%、(13.37±2.17)%、(19.42±3.35)%和(53.26±4.86)%。Western blot进一步证实了上述结论。细胞周期测定发现：BTZ联合NCTD后G0/G1、S期细胞减少，而G2/M期细胞明显增加。3BTZ单药组与联合组比较，NF-kB P65mRNA的表达量由(1.03±0.10)降至(0.29±0.04)，Survivin、Bcl-2mRNA表达量分别由(1.06±0.04)和(0.88±0.17)降至(0.35±0.01)和(0.28±0.06)，而Bax则由(2.53±0.19)升至(5.66±0.44)。4BTZ单药组与联合组比较，U266细胞胞核NF-κB P65、胞浆p-NF-κBP65蛋白的表达分别由(1.08±0.11)和(0.20±0.08)降至(0.61±0.08)和(0.01±0.005)，而胞浆NF-κB-P65的表达无明显改变。NCTD和BTZ还可抑制U266细胞IkBα的磷酸化，进而促进胞浆IκBα的表达。5与联合组相比，BTZ单药组Survivin和Bcl-2蛋白的表达分别由(0.91±0.18)和(0.56±0.10)降至(0.31±0.07)和(0.20±0.05)，而Bax则由(0.78±0.10)升至(2.43±0.34)。6体内动物实验证实：NCTD和BTZ均能抑制裸鼠移植瘤生长，联合组的抑瘤率（84%）高于BTZ和NCTD单用组（分别为67%和59%）。单药组和联合组均没有发现明显的副作用。结论:1单独应用NCTD和BTZ均可抑制U266细胞的生长，二者联合后，抑制更加显著，其机制与调控细胞周期、诱导凋亡有关。2NCTD和BTZ均可抑制骨髓瘤荷瘤裸鼠移植瘤的增殖和生长，二者合用后，BTZ的抗骨髓瘤作用加强。3NCTD可通过抑制NF-κB/IκBα途径，调节下游信号分子Survivin、Bcl-2、Bax的表达，增强BTZ的抗骨髓瘤效应。