[研究背景]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)可引发慢性肝炎、肝硬化等疾病,是引发肝细胞癌(hepatocellular carcinomas,HCC)的主要因素之一,严重危害人类健康。乙型肝炎病毒调节蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)是HBV基因编码的一种高度保守的蛋白,含有154个氨基酸。文献报道,HBx的转录活性对HBV病毒复制功能起到非常重要的作用,是病毒DNA复制的中心调解器。此外,HBx还参与基因转录、信号转导、细胞凋亡、蛋白质降解等过程,并在HCC的发生和发展过程中发挥重要的作用。HBx 与 DDB1(damage-specific DNA binding protein 1)相互作用对病毒感染及病毒基因组复制、基因不稳定性及细胞凋亡均有促进作用。2010年,Li,T.等解析出全长DDB1与HBxα螺旋结构域(88-100aa)的复合物的结构,该研究表明HBx通过它高度保守的α螺旋结构域结合DDB1,与宿主Cul4-DDB1-Roc1泛素连接酶形成新的复合物。2016年,Decorsiere,A.等发现HBx通过劫持宿主Cul4-DDB1-Roc1泛素连接酶促进Smc5/6的蛋白质降解,Smc5/6是一种对HBV基因复制有抑制作用的复合物。近些年的研究表明HBx α螺旋结构域以外的区域同样对HBV病毒复制的最大化起到重要作用,但由于缺乏HBx全长蛋白质结构信息,HBx α螺旋结构域以外的区域是如何结合相互作用蛋白并且促进HBV病毒复制的机制尚不清楚。除此以外,与HBx相互作用的蛋白还包括HBxIP(HBx-interactingprotein)、Siah-1(Seven in absentia homolog 1)等。HBxIP的氨基端区域可有效结合HBx,而HBx的137-140aa序列则参与结合HBxIP。HBxIP与HBx相互作用发生在细胞分裂的前中期,HBxIP能和HBx的羧基末端特异性地形成复合物,且两者一起定位于中心体,最终致使中心体复制过多进一步产生三极或多极纺锤体。据报道,Siah-1能够促进HBx的多聚泛素化修饰,并起到降解HBx的作用。Siah-1与HBx的相互作用区域位于Siah-1的半胱氨酸富集区(98-135aa)和HBx的转录活化结构域(50-136aa)。文献曾报道Siah-1可以降解全长HBx,却不能降解HBx羧基端缺失的突变体。因此,HBx羧基端缺失的突变体更具有促癌作用。HBV基因组在整合到宿主基因组时,时常会发生断裂,产生截短体。2015年,Wu,Q.等在HBV感染后的肿瘤组织中发现了高表达的HBx截短体1-127aa与43-154aa。这两种截短体都能促进HBV的复制和转录。以往的文献表明,采用昆虫细胞或大肠杆菌表达系统表达和纯化该蛋白时,无论是全长的HBx还是截短体均以包涵体的形式存在,极少部分以可溶性蛋白的形式存在。在以前的文献中,HBx蛋白的纯化多采用变性-复性的方法从包涵体中分离出目的蛋白。然而,蛋白质变性-复性过程可能会使蛋白质的三级结构受损,尤其是会影响具有多个半胱氨酸的蛋白质的三维结构。因此,变性复性后的HBx并不适合用于蛋白质结晶实验。依据文献报道,麦芽糖结合蛋白(Maltose binding protein,MBP)是一种大肠杆菌的内源性的蛋白质,在大肠杆菌中具有极高的表达量。在目的蛋白的氨基端添加该标签蛋白时,可以大幅度地提高目的蛋白的可溶性表达量,并且可以帮助目的蛋白在大肠杆菌中正确折叠并保持原有的活性。但是,MBP-HBx重组蛋白自身会形成多聚体,不仅阻碍蛋白质晶体的形成,也无法和它的结合蛋白在细胞外相互作用。[研究目的]基于以上研究背景,本研究探讨如何利用大肠杆菌系统获得大量的可溶性的单体型的HBx重组蛋白,通过蛋白质结晶实验获得优质的蛋白质晶体,为今后解析HBx重组蛋白的三维结构、研究HBx与其结合蛋白之间的相互作用机制和探讨HBx生物学功能提供基础。[研究方法]一、筛选多个标签蛋白,寻找有助于提高目的蛋白在大肠杆菌中可溶性表达量的标签蛋白。二、根据文献报道,构建两个较稳定的HBx截短体1-127aa与43-154aa,并添加氨基端MBP标签获得重组蛋白表达质粒。三、通过Swissmodel软件预测HBx形成多聚体的疏水界面,经过点突变实验,发现有利于获得单体型的重组蛋白的突变型。四、采用亲和层析法、离子交换层析法、分子体积排阻色谱法等纯化手段大规模表达纯化最优的表达质粒。.五、将纯化后所获得的高浓度、高纯度的HBx重组蛋白用于蛋白质结晶实验,经过结晶试剂盒筛选,初步筛选出重组蛋白的结晶条件。[研究结果]一、与文献中报道的类似,我们发现添加Gst或His标签蛋白并不能提高HBx重组蛋白的可溶性表达量和改善蛋白质的稳定性,但是添加MBP标签蛋白可以明显的提高重组蛋白的可溶性表达量。二、经过一系列尝试,我们确定His-MBP-HBx 43-154aa是最佳表达质粒。由于野生型重组蛋白质是多聚体,无法结晶。我们依据软件预测结果,针对蛋白质疏水界面上的若干个氨基酸依次进行突变,最终,我们获得最佳突变组合是F73D/F132D/V133D。利用这样的组合,我们可以获得最多的单体型重组蛋白(单体型比例占34.48%)。三、经过一系列蛋白质纯化实验,我们获得了高浓度、高纯度(10.27mg/ml,目的蛋白比例占72.10%)的HBx重组蛋白。通过结晶试剂盒筛选,我们初步获得梭形蛋白质晶体,结晶试剂包含pH 8.5(0.1M Bis-tris propane)、Sodium Citrate(0.1M)和PEG 3350(30%)。晶体生长温度为20℃,生长周期约14天。[创新点]一、我们通过构建多个HBx重组蛋白质粒,发现His-MBP-HBx43-154aa可溶性蛋白表达量最高,并且蛋白质稳定性好,适合进行下一步HBx的大规模表达和纯化实验。二、我们首次通过点突变的方法获得单体型的HBx重组蛋白,用于蛋白质结晶实验。经过初步的试剂盒筛选,我们获得了重组蛋白的梭形晶体。