论文部分内容阅读
前言:
腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)的主要替代方式之一。与血液透析相比,其具有费用相对较低、有较佳的血流动力学稳定性、能延缓残余肾功能下降速度、较好的清除中分子物质、对生活方式的影响较小等优点而被更多的ESRD患者所接受。然而,在长期腹膜透析过程中,腹膜长期与非生理性的含糖腹透液持续接触,以及反复发生的腹膜炎等诸多因素最终可导致腹膜纤维化(Peritoeneal Fibrosis,PF)的发生,临床上出现超滤失败成为长期腹膜透析患者退出的主要原因。因此探讨PF的发生发展机制、并寻找有效的防治措施具有重要的科学意义和临床使用价值。
近年来的研究发现,以高糖(high glucose,HG)成分为主的腹膜透析液可以导致腹膜间皮细胞(Rat peritoneal mesothelial cell,RPMCs)发生向肌成纤维细胞的转分化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)。EMT是腹膜发生纤维化的众多环节中的起始环节和可逆阶段。因此,临床上对EMT的防治可能会延缓腹膜纤维化的进程。其主要特征是失去上皮细胞的特性并获得成纤维细胞合成细胞外基质(extracellular matrix components,ECM)的特性。关键步骤包括上皮细胞粘附连接的丢失;细胞骨架的重组;以及基底膜的瓦解和细胞迁移、侵袭的增强。发生转分化的腹膜间皮细胞具有肌成纤维母细胞的特性,其迁移能力和侵袭性显著增强,并且分泌多种细胞因子,从而在腹膜纤维化及血管增生中发挥作用。因此,腹膜间皮细胞的EMT是腹膜透析患者腹膜功能逐渐降低、纤维化的关键环节之一。
锌是机体内除铁以外含量最高的过渡元素,在细胞生物中起着稳定结构、催化和调节的作用,是人体内300多种酶和转录因子的重要组成成分,直接参与了核酸、蛋白质的合成、细胞的分化和增殖以及许多重要细胞代谢过程。锌缺乏会引发机体发育迟缓、厌食、皮肤损坏、骨骼畸形、免疫力低下等症状。因此,锌离子代谢的稳态平衡对维持机体正常生理功能至关重要。文献证实,终末期肾脏病患者,其中包括血液透析和腹膜透析的患者均存在不同程度的锌缺乏。以往研究证实,锌补充能够抑制或减轻一些动物模型的纤维化和临床上的慢性炎症疾病,例如:肝纤维化、心肌纤维化、血管纤维化以及系统性纤维化等。锌还可以抑制氧化应激反应,而氧化应激反应是EMT的发生和发展的主要机制之一。相反,锌缺乏能够破坏上皮细胞膜完整性和功能,影响胶原蛋白的合成等加重或导致纤维化。
锌离子不能自由通过细胞膜,特定的转运蛋白和膜通道参与锌的转运和代谢。在维持锌稳态的蛋白家族中,锌转运体(ZnTs)特别重要。ZnT1-7是金属离子运载体阳离子扩散促进者(CDF)家族的成员,其作用是将锌转运出细胞或传递到细胞器内。越来越多的证据表明ZnTs不仅直接参与了细胞的锌离子稳态代谢,同时还通过复杂的机制影响着肿瘤和慢性炎症性疾病等疾病的发生和发展。近期的研究证实,特定锌转运体基因的表达在调节锌离子介导的炎症状态下大鼠肺上皮细胞、肝脏细胞膜功能障碍的细胞保护作用中起到非常重要的作用。
本实验旨在研究锌离子及ZnTs介导的锌离子转运对HG诱导的RPMCs的EMT的影响,并进一步探求其影响的相关机制。本研究将为明确锌离子在腹膜透析液中的应用以及腹膜透析相关性腹膜纤维化中的作用和相关机制,寻找有效干预腹膜纤维化的关键环节与分子靶点提供新的科学依据。
实验方法:
采用HG诱导RPMCs制备的EMT体外模型,瞬时转染hZnT-7,ZnT7 siRNA基因的RPMCs为研究对象,应用原子吸收光谱方法检测各组细胞内锌含量的变化,应用免疫荧光和Western Blot技术检测EMT指标的表达变化,应用Real-timePCR技术检测基础和HG刺激后的RPMCs内ZnTs的表达变化,应用RNAi技术阻抑ZnT7基因和瞬时转染hZnT-7过表达ZnT7基因在RPMCS的表达,并应用RT-PCR技术检测RNAi对ZnT7的基因沉默效果和hZnT-7过表达的效果,采用Western Blot技术、免疫荧光技术、ELISA技术、MTT等技术检测锌离子及ZnT7对HG诱导的RPMCS的EMT的影响及相关机制。
实验结果:
1、HG对细胞活力的影响
MTT结果显示,HG处理RPMCs后,细胞活力逐渐降低,具有剂量依赖性和时间依赖性的特点。
2、锌离子对HG作用下细胞活力的影响
MTT结果显示,HG处理RPMCs后,细胞活力逐渐降低,具有剂量依赖性和时间依赖性的特点,而加入10μmZnSO4细胞活力升高。
3、锌离子对HG诱导的EMT的表达的影响
HG刺激RPMCs导致α-SMA、CollagenⅠ表达增加,E-cadherin表达减少,RPMCs向肌成纤维细胞转分化,而锌螯合剂导致α-SMA、CollagenⅠ表达进一步增加,E-cadherin表达明显减少。加入ZnSO4后,发现α-SMA、CollagenⅠ表达降低,E-cadherin表达增多。
4、锌离子对HG诱导的TGF-β1分泌及ROS的表达的影响
HG刺激RPMCs导致TGF-β1分泌及ROS的表达增加,而锌螯合导致其表达进一步增加。加入ZnSO4后,发现TGF-β1分泌及ROS的表达下降。
5、锌离子对HG诱导的MAPK、NF-κB、TGF-β/Smad信号通路的影响
HG刺激RPMCs导致MAPK、NF-κB及TGF-β/Smad信号通路的激活,加入ZnSO4后,发现MAPK、TGF-β/Smad信号通路关键蛋白表达下调。
6、ZnTs在正常和HG作用下的体外培养的RPMCs的表达变化
Real-time PCR结果显示,正常RPMCs存在ZnT1-7的表达,HG刺激后ZnT7基因和蛋白的表达明显升高。
7、RNAi对ZnT7基因的沉默效果
RT-PCR结果显示,RNAi可在mRNA水平明显抑制RPMCs的ZnT7表达,干扰后24 h即可出现ZnT7的表达下降,干扰后48 h为抑制效果最佳时间点,ZnT7表达量仅为对照组的24%。
8、hZnT-7-pcDNA3.1/myc-hisA对ZnT7基因过表达效果
RT-PCR结果显示,hZnT-7-pcDNA3.1/myc-hisA可在mRNA水平明显升高RPMCs的ZnT7表达,转染后24h即可出现ZnT7的表达升高,转染后48 h为过表达效果最佳时间点。
9、ZnT7过表达和基因沉默对细胞活力的影响
MTT结果显示,单纯ZnT7-RNAi和ZnT7过表达对细胞活力没有明显影响,在126mM HG处理的情况下,ZnT7过表达可提高RPMCS活力17.5%,而ZnT7-RNAi可降低大鼠腹膜间皮细胞活力10.5%。
10、ZnT7过表达和基因沉默对细胞锌转运的影响
Zinquin荧光染色结果显示,荧光显微镜下观察,可见锌离子在ZnT7-RNAi组细胞核周围的聚集明显低于对照组细胞,而在hZnT-7转染组细胞核周围的聚集明显高于对照组细胞
11、ZnT7过表达和基因沉默对EMT标记蛋白(α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin)表达的Westren-blot分析
单纯ZnT7基因沉默和过表达后α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin的表达无明显变化,而在HG刺激后,ZnT7-RNAi导致α-SMA、CollagenⅠ表达升高,F-cadherin表达降低,而转染hZnT-7则α-SMA、CollagenⅠ表达降低,E-cadherin表达增多。
12、ZnT7过表达和基因沉默对TGF-β1分泌及TGF-β/Smad信号通路关键蛋白表达的分析
Elisa结果显示,ZnT7-RNAi干扰48 h后,予以HG作用48h,RPMCs培养液内的TGF-β1蛋白含量,TGF-β/Smad信号通路的关键蛋白p-smad3和p-smad4蛋白表达较对照组和HG组明显升高,而hZnT-7转染/HG组的TGF-β1蛋白含量,p-smad3和p-smad4蛋白表达较对照组和HG组明显降低。
13、统计分析
数据均以均数士标准误表示,采用SPSS17.0软件包进行统计学处理,各组间比较采用单因素方差分析,样本均数间的两两比较采用Tukeys检验,以P<0.05为差异有显著性。
结论:
1、锌补充可阻抑HG诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化,而锌缺乏可促进HG诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化。
2、锌离子抑制HG诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化的机制是:
①锌可通过抑制氧化应激反应及关键纤维化因子的过表达而抑制大鼠腹膜间皮细胞的的转分化。
②锌可通过抑制MAPK、 TGF-β/Smad和NF-κB信号通路的活化而抑制大鼠腹膜间皮细胞的的转分化。
3、大鼠腹膜间皮细胞存在ZnT1-7的表达,ZnT7与HG诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化有关。
4、ZnT7基因沉默可促进HG诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化,而ZnT7过表达可抑制HG诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化。
5、ZnT7调节HG诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化是通过调节TGF-β/Smad信号通路实现的。