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Tat(Trans-activator transcription)蛋白的蛋白转导区域(Protein transduction domain,PTD)——PTD-Tat 能介导其融合的蛋白的转导及细胞内定位。就理论而言,较之 N 端融合,PTD-Tat 的 C 端融合更有利于外源蛋白的表达。因此,对融合在外源蛋白 C 端的跨膜递送作用进行探讨具有研究意义。 本研究用 DNA 重组技术将 PTD-Tat 融合在绿色荧光蛋白(green fluorescence protein ,GFP)的羧基(C)端,构建重组表达质粒 pGEX-GFP-Tat;转化大肠杆菌 BL21(DE3),IPTG 诱导其表达后,采用谷胱甘肽-Sepharose 4B(GS-4B)亲和层析,获得纯化的谷胱甘肽 S-转移酶(GST)融合的重组蛋白GST-GFP-Tat;用于研究融合在外源蛋白 C 端的 PTD-Tat 的跨膜递送作用。 通过融合蛋白 GST-GFP-Tat 与体外培养的 Hela 细胞共培养,荧光显微镜观察和流式细胞仪分析表明:其一,融合蛋白 GST-GFP-Tat 能高效地跨膜进入细胞,且定位于细胞核周围。其二,其跨膜递送与时间、浓度有依赖关系,即 37℃条件下 15min 细胞内可观察到绿色荧光,且荧光强度随着蛋白浓度的增高而增强。其三,温度对跨膜递送作用影响较大,37℃条件下有高跨膜效率的融合蛋白 4 ℃时跨膜递送作用几乎完全被抑制。其四,细胞膜表面的硫酸乙酰肝素(Heparin sulfate ,HS)对 GST-GFP-Tat 的跨膜递送具有重大影响,而代谢抑制剂并不影响其跨膜递送。其五,MTT 实验表明该融合蛋白对细胞无毒性。 此外,本研究通过融合蛋白 GST-GFP-Tat 与 GFP 氨基(N)端含有 PTD-Tat的融合蛋白 GST-Tat-GFP 的阳性对照组的对比发现:流式细胞仪的分析显示 4.0 μmol/L 的蛋白浓度下 GST-GFP-Tat 的转导效率高达 80.0 %,而 GST-Tat-GFP的转导效率只有 32.9 %;荧光显微镜的观察结果与其一致。 最后,动物实验证明该融合蛋白具有跨膜递送的作用:其一,小鼠的皮肤涂抹实验表明 GST-GFP-Tat 能沿着毛囊进到皮肤的真皮层。其二,小鼠的腹腔注射实验则表明 GST-GFP-Tat 能有效递送到小鼠体内各个组织,甚至跨越小鼠的血脑屏障;与阳性对照组的 GST-Tat-GFP 的比对显示其荧光强度较强,尤其两种融合蛋白在跨越血脑屏障方面存在明显差异。其三,融合蛋白喂食线虫发现蛋白进入其整个消化道及其原体腔,且与喂食时间与蛋白浓度呈正相关关系。 通过对融合在 GFP 之 C、N 端的 PTD-Tat 跨膜递送的比较分析,表明 C 端融合之 PTD-Tat 同样具有介导外源蛋白的跨膜递送作用,不仅跨膜递送进入细胞,且实现组织水平上的成功应用;而且 C 端融合之 PTD-Tat 甚至表现出更强的跨膜活性;此外,融合蛋白对细胞未造成毒性。这些结论将为 PTD-Tat 在蛋白药物递送方面的有效应用提供理论指导。