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目的:我国胃癌死亡率居恶性肿瘤之首,化疗作为肿瘤术后最有效的辅助治疗手段,在防治肿瘤的复发与转移方面作用举足轻重。虽然目前胃癌的化疗方案不断完善,但部分胃癌患者对化疗的疗效并不理想,其中多药耐药(multidrug resistance, MDR)是导致化疗失败的根本所在。MDR是指肿瘤组织对多种化学结构完全不同,作用机理各异的抗肿瘤药物具有交叉耐受性质。MDR现象有两种表型:一种是首次使用化疗药物就产生耐药,称为原发性耐药;另一种则是在化疗过程中产生耐药,称继发性耐药。胃癌具有原发性耐药和继发性耐药的双重特点。有研究证明P-糖蛋白(P-gp)的过表达是胃癌产生MDR的最为突出的普遍的变化。Livin和Survivin同属于凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族,它们在介导肿瘤细胞的凋亡及多药耐药方面发挥着重要的调控作用,其中Livin是IAP家族的新成员。奥沙利铂(Oxaliplatin, L-OHP)是继顺铂和卡铂之后的第三代铂类抗癌药,已逐渐作为治疗进展期胃癌的主要药物,并显示出良好的应用前景。虽然国内外已建立起不同胃癌耐药细胞系,但胃癌奥沙利铂耐药细胞系的建立以及Livin和Survivin在低分化胃癌耐药细胞和亲本细胞中表达的研究尚未见报道。为进一步揭示胃癌多药耐药的机理,本研究首次建立人胃癌耐药细胞系OCUM-2MD3/L-OHP,研究其细胞生物学特点以及P-gp、Livin和Survivin与胃癌多药耐药的关系,并对P-gp、Livin和Survivin介导多药耐药的机制作了初步探讨。方法:人胃癌高侵袭转移细胞系OCUM-2MD3在DMEM培养液中,37℃、5%的CO2饱和湿度下培养,用0.25%的胰蛋白酶消化传代;采用大剂量L-OHP24h反复间歇暴露法建立人胃癌高侵袭转移奥沙利铂耐药细胞系OCUM-2MD3/ L-OHP;应用倒置相差显微镜和电镜观察耐药细胞系的形态学改变;通过细胞计数法绘制细胞生长曲线,根据公式:Td(h)=T×[log2/(logN-logN0)],计算耐药细胞系的倍增时间;应用流式细胞仪(FCM)检测药细胞系的细胞周期分布和凋亡情况;应用MTT法测定耐药细胞系的药物敏感性;应用流式细胞仪检测P-gp、Survivin及Livin在耐药细胞系及其亲本细胞系中的表达。实验数据用SPSS 12.0统计软件处理,P<0.05时认为差异具有显著性。结果:历时6个月建成人胃癌高侵袭转移奥沙利铂耐药细胞系OCUM-2MD3/L-OHP。1 OCUM-2MD3/L-OHP细胞系的细胞生物学特点1.1 OCUM-2MD3/L-OHP细胞系的细胞形态学特征倒置相差显微镜下OCUM-2MD3/L-OHP细胞系与OCUM-2MD3细胞系细胞相比,形态无明显改变。透射电镜下,亲本细胞细胞表面微绒毛丰富;胞质内细胞器形态正常;细胞核大、形态不规则,常染色质丰富异染色质少,核仁大而明显。与之相比,大部分耐药细胞无异常改变,一小部分耐药细胞出现典型的细胞凋亡形态学改变:细胞表面微绒毛减少、变短;细胞质浓缩,大小不等空泡形成;粗面内质网扩张,脱颗粒现象明显;线粒体水肿、空泡变,线粒体嵴大部分融合、消失;核大而不规则,染色质浓缩,电子密度增加,边集于核膜下形成半月状。1.2 OCUM-2MD3/L-OHP细胞系的群体倍增时间OCUM-2MD3/L-OHP细胞系的群体倍增时间为27.0±2.04小时,与OCUM-2MD3细胞系相比,增殖速度减慢,群体倍增时间延长约3小时(P<0.05)。1.3 OCUM-2MD3/L-OHP细胞系的细胞周期分布及凋亡OCUM-2MD3/L-OHP细胞系细胞周期分布情况为:G0/G1期66.03±0.28 %、S期10.4±1.06 %、G2/M期23.25±0.78 %,细胞凋亡率为5.21±0.55 %。与OCUM-2MD3细胞细胞系相比,G0/G1与G2/M期细胞增多,S期细胞减少,细胞凋亡率增高(P<0.05)。两种细胞系经L-OHP处理24小时后显示:耐药细胞系S期细胞增多,亲本细胞系G2/M期细胞增多(P<0.05),即耐药细胞系被L-OHP阻滞在G2/M期,亲本细胞系被阻滞在S期;同时两种细胞的凋亡率均明显增加,其中耐药细胞系细胞凋亡率低于亲本细胞系(P<0.05)。1.4 OCUM-2MD3/L-OHP细胞系对L-OHP的敏感性及其耐药指数(RI)测定随L-OHP浓度增高L-OHP对OCUM-2MD3细胞系以及OCUM-2MD3/L-OHP细胞系的抑制作用逐渐增强,同一浓度L-OHP对耐药细胞系的抑制率明显低于亲本细胞系(P<0.05),耐药细胞系对L-OHP的耐药指数为4.5。耐药细胞经反复传代、冻存、复苏后,复测其耐药指数仍保持不变。1.5 OCUM-2MD3/L-OHP细胞系多药耐药检测L-OHP、IH、CDDP、CBDCA、5-Fu、ADM、MMC、GEM、VCR、PTX等10种化疗药对OCUM-2MD3/L-OHP细胞系的抑制率明显低于OCUM-2MD3细胞系(P<0.05)。以抑制率<50%作为界定耐药的标准,亲本细胞系对MMC、VCR和IH耐药;耐药细胞系除对L-OHP耐药外,其对CDDP、ADM和PTX的敏感性降低,对CBDCA、5-Fu、MMC、GEM、VCR和IH表现为交叉耐药。2 P-gp、Livin及Survivin在OCUM-2MD3/L-OHP细胞系中的表达情况.2.1 P-gp在OCUM-2MD3/L-OHP细胞系中的表达P-gp在OCUM-2MD3/L-OHP和OCUM-2MD3细胞系中均有表达,其在耐药细胞系中的表达高于亲本细胞系(P<0.05),两种细胞系经L-OHP处理24小时后,P-gp表达量均降低(P<0.05),处理组中P-gp在耐药细胞系中的表达仍高于亲本细胞系(P<0.05)。2.2 Livin在OCUM-2MD3/L-OHP细胞系中的表达Livin在OCUM-2MD3/L-OHP和OCUM-2MD3细胞系中均有表达,且表达量无差异(P>0.05),两种细胞系经L-OHP处理24小时后,Livin的表达量均降低(P<0.05),处理组中Livin在耐药细胞系中的表达高于亲本细胞系(P<0.05)。2.3 Survivin在OCUM-2MD3/L-OHP细胞系中的表达Survivin在OCUM-2MD3/L-OHP和OCUM-2MD3细胞系中均有表达,其在耐药细胞系中的表达低于亲本细胞系(P<0.05),两种细胞系经L-OHP处理24小时后,Survivin的表达量均降低(P<0.05),处理组中Survivin在耐药细胞系和亲本细胞系中的表达无差异(P>0.05)。结论: 1 OCUM-2MD3细胞系具有原发多药耐药特点,其耐药机制与P-gp、Livin和Survivin的表达有关。2 OCUM-2MD3/L-OHP细胞系对L-OHP耐药指数为4.3,为低度耐药且耐药稳定,此外耐药细胞对CBDCA、5-Fu、MMC、GEM、VCR和IH等多种抗癌药产生交叉耐药,具有继发多药耐药特征。3 OCUM-2MD3/L-OHP细胞系继发多药耐药的机制与其细胞周期分布发生改变、倍增时间延长以及P-gp表达上调有关。4 P-gp、Livin和Survivin介导多药耐药的机制与其抑制肿瘤细胞凋亡有关。综上所述,本研究成功建立OCUM-2MD3/L-OHP细胞系,并可用于胃癌多药耐药机制的研究。通过检测P-gp、Livin和Survivin在胃癌耐药细胞系中的表达,并揭示其耐药机理有助于预防临床化疗过程中多药耐药现象的出现,避免化疗过程中的盲目性,以达到指导胃癌术后个体化化疗的的目的。但由于肿瘤多药耐药机制的复杂性,关于胃癌多药耐药的机制尚有待进一步深入研究。