流行性乙型脑炎(Japanese Encephalitis,JE),简称乙脑,是一种重要的蚊媒传染病,其传播媒介主要是三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus),病原体是日本脑炎病毒(Japanese Encephatlitis virus,JEV),主要感染儿童和青少年,病死率可达10%以上,一半以上的幸存者会留下神经系统缺陷,是人类健康的严重威胁。另外,乙脑病毒也容易造成受感染的母猪流产或畸胎,对养殖业危害巨大。为阐明三带喙库蚊种群特征及感染流行性乙型脑炎病毒特点,从而科学有效地防控流行性乙型脑炎,本研究主要从生态学和分子生物学、群体遗传学等角度开展了三方面研究:1.流行性乙型脑炎主要媒介三带喙库蚊种群分布特征研究。在江苏省长江入海口两岸选择启东市和太仓市作为调查地点,调查以鸡、猪为诱饵的蚊虫种类构成和三带喙库蚊种群数量季节变化,同时调查三带喙库蚊在农村猪圈、民居和草地等生态环境的种群分布。通过收集江苏省病媒生物监测网络中2009年-2015年蚊虫监测数据,对三带喙库蚊在城市城区范围内公园、居民区和医院不同生境分布和动态变化进行了分析。研究结果发现,三带喙库蚊以叮吸猪等家畜类血液为主,主要分布于猪圈、牛棚等生境,其次是民居,在江苏每年从5月开始出现,然后密度逐渐升高,7-8月达到密度高峰,随后密度逐渐下降,10月基本监测不到该蚊种。基于鸡为诱饵的三带喙库蚊种群数量较少,在江苏主要出现在6-8月。研究同时发现,至少从2009年开始,三带喙库蚊已经在江苏各市的城区范围内出现,主要分布于公园,居民区和医院等场所分布相对较少,高峰主要出现在8月,这可能是由于农村生态环境和经济模式改变造成生存压力所致。2.三带喙库蚊线粒体DNA和微卫星特征分析。采集三带喙库蚊标本,提取基因组DNA,对线粒体全长进行测序。从Gen Bank检索下载5属33种蚊虫线粒体全长和COⅠ基因序列,与三带喙库蚊相应序列构成数据,探讨线粒体DNA全长用于三带喙库蚊分子分类鉴定的可行性和优势。本研究系首次对三带喙库蚊线粒体全长进行了测序。通过构建进化树,对线粒体全长和COⅠ基因用于三带喙库蚊分子分类鉴定进行了研究,发现线粒体基因组全长可以用于三带喙库蚊分子分类鉴定,由于序列更长,含有更丰富的生物信息,相对于线粒体上COⅠ基因可以更细致的对蚊虫种类进行区分。采集16个地理种群的三带喙库蚊,每个地理种群挑选5-6只蚊虫,每只蚊虫作为一个样本提取DNA,设计引物扩增线粒体ND4和ND5基因。分析发现,ND5基因比ND4基因拥有更高比例的多态性位点和更多的单倍型数,相对更适合做种群进化分析的分子标记。三带喙库蚊ND4和ND5单倍型与地理位置无明显对应关系,种群间分化程度小。采集20个地理种群的三带喙库蚊,每个地理种群挑选30只蚊虫,每只蚊虫作为一个样本提取DNA,设计引物筛选出10个微卫星DNA位点。PCR扩增后对微卫星DNA数据进行种群遗传学分析。结果表明,本研究中单地点30次重复采样能够代表对应地理种群的整体情况,20个地理种群的观察杂合度均低于预期杂合度,种群近交系数基本在0.1以上,10个位点群体间近交系数(0.141)大于群体内近交系数(0.006),10个微卫星位点的基因流平均值为10.4703,64.7%的种群间成对固定指数Fst未表现出明显的遗传分化,这些参数结果表明三带喙库蚊种群间近交明显,基因交流频繁。3.三带喙库蚊和宿主携带流行性乙型脑炎病毒和病毒基因组特征分析。2015-2016年在江苏省4个城市9个地点的猪圈中以诱蚊灯法采集三带喙库蚊,其中连云港小高庄和新滩村在2015年和2016年分别在同一地点进行了2次采集,其余地点均为2016年采集。以50只蚊虫为一组,提取RNA,设计引物,RT-PCR法扩增乙脑病毒核酸。结果显示,乙脑病毒在三带喙库蚊中的感染比例较高,本研究中,阳性样本份数比例基本在10%以上,近一半在50%以上,最高为泰州张家院村,达到了80%。最小感染率(IR)也有近一半在10%以上,最高为16.00‰,而最大似然估计值(MLE)比相应的最小感染率值都大,感染情况越严重,两者的误差越大。2014年在江苏省分别采集小苇鹣、小白鹭和池鹭血清样本13、12和2份,提取核酸后进行PCR扩增,未检测出乙脑病毒。2014年3-10月,每月在启东和太仓分别采集幼猪和母猪血清标本,以ELISA法检测抗乙脑病毒Ig G抗体,以乳胶凝集法检测Ig M抗体,结果发现猪对乙脑病毒Ig M和Ig G抗体自6月开始升高,7-8月达到高峰,9月开始逐渐下降。将抗体阳性的血清标本提取核酸检测乙脑病毒,未发现阳性。2014年4-9月,每月在屠宰场采集猪脑,提取核酸检测乙脑病毒,结果在228份猪脑中均未检出乙脑病毒核酸。从三带喙库蚊每个地理种群乙脑病毒检测阳性的标本中挑选1-2份对乙脑病毒E基因进行测序。2015-2016年共获得17株乙脑病毒的E基因序列,其中2015年从连云港3地的三带喙库蚊中获得4株乙脑病毒E基因序列,2016年从宿迁、南京、泰州和连云港的三带喙库蚊中获得12株乙脑病毒的E基因序列,从泰州张家院十四组的中华按蚊中获得1株乙脑病毒的E基因序列。根据E基因序列构建进化树进行基因分型,17株乙脑病毒在基因型上均属于GⅠ-b型,氨基酸序列与减毒疫苗株SA14-14-2比较,抗原关键位点E332、E304和E335相同。17株乙脑病毒毒力关键位点E138和E176相同,但与SA14-14-2株不同,表明17株乙脑病毒与SA14-14-2株抗原性相似,但毒力可能强于SA14-14-2,这表明基于SA14-14-2的乙脑疫苗目前在江苏省内仍然有效,但需要进一步加强乙脑病毒的监测。本研究中2015年和2016年在同一地点检测到的乙脑病毒E基因核酸和氨基酸序列有完全相同的情况,而在南京、宿迁和泰州分别检测到E基因核酸和氨基酸序列完全相同的的乙脑病毒,这可能是候鸟等水禽迁徙带入或三带喙库蚊迁飞带入所致。