论文部分内容阅读
自身免疫调节因子(Autoimmune regulator, AIRE)是一种在调控胸腺中枢耐受中发挥着重要作用的转录激活因子。人类Aire基因的突变将导致由自身免疫应答所介导的、以多器官损伤为特征的APECED。其典型临床表现为甲状旁腺功能减退,Addison’s病和慢性皮肤粘膜念珠菌感染的三联征。在胸腺中,AIRE主要表达在胸腺髓质上皮细胞(Medullary thymic epithelial cell, mTEC),通过调控该细胞上大量组织限制性抗原(Tissue restricted antigens, TRA)的表达,进而在自身反应性T细胞的阴性选择中起重要作用。AIRE在外周淋巴器官和组织,以及CD14+DC、单核/巨噬细胞、B细胞和粒细胞中也有表达。和胸腺中相比,AIRE在外周中的作用,尤其在血源性细胞中表达的作用,现在还不是十分清楚。而且到目前为止,APECD病人对念珠菌显著易感的原因同样尚不清楚。为了阐明AIRE在外周血源性细胞中表达的作用和意义,本研究在建立稳定表达AIRE的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞模型的基础上,探讨AIRE对巨噬细胞上TLRs表达的影响以及可能的调控机制,并检测AIRE调控的TLRs在相应配体刺激后下游靶基因的变化情况；此外,初步分析了AIRE对巨噬细胞活化类型的影响。1建立AIRE稳定表达的巨噬细胞RAW264.7模型通过构建含小鼠Aire基因的真核表达质粒pEGFPC1/mAire,经转染、筛选和鉴定,得到了稳定表达GFP-AIRE融合蛋白的RAW264.7细胞(A33-3)以及稳定表达GFP蛋白的RAW264.7细胞(C1-6),为进一步的实验奠定基础。2 AIRE对巨噬细胞上TLRs表达的影响及其调控机制为了了解AIRE是否可以调控巨噬细胞上TLRs的表达,我们通过荧光定量PCR和Western blotting检测了A33-3与C1-6细胞之间TLRs表达差异。结果显示,在A33-3细胞中AIRE可以调控TLR1、TLR3和TLR8的表达。通过染色质免疫共沉淀(CHIP)和萤光素酶报告基因活性分析,进一步发现AIRE通过与TLR1、TLR3和TLR8的启动子相互作用,进而调控它们的表达。而且,通过TLR1和TLR3配基的刺激,我们发现AIRE能够增加其相应下游靶基因产物的表达。这些数据提示,在外周抗原提呈细胞(APC)中,AIRE可能通过调控TLRs的表达,进而对病原微生物的识别和外周免疫耐受的调控起着重要作用。3 AIRE对巨噬细胞活化类型的影响为了了解AIRE是否对巨噬细胞活化类型产生影响,我们分别用LPS、IL-4以及LPS联合免疫复合物(OVA：抗OVA)刺激A33-3和C1-6细胞,然后分别检测活化后的M1, M2a和M2b型巨噬细胞特异性细胞因子的表达变化情况。结果发现,三种不同的刺激物可以使RAW264.7细胞分别向M1、M2a和M2b三种类型活化,AIRE可能对M1型的活化有促进作用,而对M2型的活化有抑制作用,尤其是M2b型,这提示AIRE可能参与调控巨噬细胞对病原微生物的免疫防御作用。本研究的意义在于,首次证实在巨噬细胞中AIRE通过与TLR1、TLR3和TLR8的启动子相互作用,能够上调这些基因的表达,提示AIRE可能在APC对病原体的识别和外周免疫耐受调节中发挥重要作用。初步证实在巨噬细胞活化过程中AIRE使其更趋向于M1型活化,有利于机体对病原体(包括真菌)的清除和提高其抗感染能力,这也为了APECED病人对真菌易感的原因提供了一个新的解释。这些研究为我们进一步了解AIRE在外周血源性细胞中表达的作用和意义提供新的实验依据。