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在乙烯合成途径中,1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶(ACC synthase即ACS)是催化乙烯前体1-氨基环丙烷1-梭酸(ACC)形成的酶,也是整个乙烯合成途径的限速酶。前期工作表明,乙烯在牡丹(Paeonia suffruticosa)切花采后开花及衰老过程中起着重要的作用,ACS是牡丹切花乙烯生物合成途径中的限速酶。因此,通过转基因技术有望ACS基因沉默,减少乙烯的生成量,从而控制切花衰老进程,延长其瓶插寿命。基于此,本研究以类似乙烯跃变型‘洛阳红’牡丹为试材,构建原核表达载体进行蛋白表达,并构建了正、反义植物表达载体用于转化烟草植株,以期为将来利用基因工程手段延长牡丹花期提供技术支持与试验保证。本研究取得的主要成果如下:1、获得‘洛阳红’牡丹ACS1基因cDNA片段。从‘洛阳红’牡丹五级盛开切花中分离出总RNA,经反转录和PCR扩增得到长为1476bp的ACS1 cDNA片段,将1476bp的cDNA片段克隆到质粒载体pGEM-T得到重组质粒pACS1。克隆片段经测序确证与Genebank中登陆的牡丹1-氨基环丙烷1-梭酸合成酶(ACS)基因片段相似性达100%,这说明克隆的cDNA片段即与牡丹衰老相关的ACS基因,将该基因命名为PsACS1。2、构建牡丹ACS1基因原核表达载体并进行蛋白表达。在牡丹ACS1基因片段两端通过再次克隆引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点,1476bp长的克隆片段经BamHⅡ和HindⅢ双酶切消化,插入到经同样双酶切消化的原核表达载体pET28a中,经PCR检测和限制性内切酶分析,证明己经成功构建ACS1基因的原核表达载体,并将其命名为pET-ACS1。通过IPTG诱导表达出接近55KD的蛋白大小,证明牡丹ACS1基因是有编码活性的。3、构建牡丹ACS1基因正、反义表达载体,以农杆菌介导的方式转化烟草植株,初步获得转基因烟草苗:以pACS1测序质粒为模板,各自以正、反义序列的扩增引物通过PCR分别扩增到一条约1.5kb的片段。两PCR纯化产物经BamHⅠ+SalⅠ双酶切回收后,经T4连接酶连接插入到经同样双酶切的PBI121n上,成功构建了正、反义植物表达载体,正义植物表达载体记为PBInACS1s,反义为PBInACS1a。以烟草幼叶为外植体,利用叶盘法,通过农杆菌GV3101介导将牡丹ACS基因导入烟草中,经PCR检测获得了抗卡那霉素的转基因烟草再生苗。