根尖周病为口腔的常见病,通常导致根尖周骨破坏,其病理过程代表了机体对根管系统内抗原物质的炎性免疫反应；因此,从免疫学角度探讨其发病机制有助于为临床治疗提供新的思路。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate, S1P)是一种具有重要生物学活性的溶血磷脂,1-磷酸鞘氨醇-1型受体(Sphingosine-1-phosphate receptor 1)为其胞膜G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor, GPCR) 之一;SIP通过自分泌或旁分泌的方式与S1P1结合,广泛调节多种免疫反应。S1P/S1P1信号轴在通过调控淋巴细胞的体内循环和T淋巴细胞的分化及功能,促进炎性免疫反应。S1P1相关的信号通路负调控具免疫抑制功能的细胞——调节性T细胞(T regulatory cells, Treg cells)的分化及功能,同时促进炎性免疫细胞——辅助性T细胞17 (T helper cell 17, Th17)细胞的分化,是自身免疫性疾病发生和发展的关键因素。S1P1及其相关信号轴不仅趋化破骨细胞前体细胞聚集在骨表面,亦可促进RANKL(为影响破骨细胞分化的关键因子)的表达上调,从而促进破骨细胞的分化及功能。新型免疫抑制性药物芬戈莫德(FTY720)在体内经磷酸化后能促进S1P1由胞外转移至胞内,从而下调S1P/S1P1信号轴,进而降低免疫应答以及其引起的骨吸收,因此对炎性溶骨性疾病具有一定治疗作用。本项目拟通过建立大鼠根尖周病模型,检测S1P1以及RANKL、Treg细胞等在根尖周病不同时期的变化,并观察局部注射靶向S1P1新型免疫抑制药物FTY720后骨破坏和S1P1及其相关因子的变化情况,以明确S1P1在根尖周病中的作用及相关机制。第一部分S1P1在根尖周病发病机制中的作用实验一实验性大鼠根尖周病模型的建立与鉴定目的：建立大鼠根尖周病模型,通过高分辨率X线成像、显微CT及组织学三种方式观察和分析不同时期根尖周骨缺损的发展和变化,以鉴定根尖周动物模型的有效性,并收集样本以供后续实验使用。方法：将55只成年雌性Wistar大鼠在全麻下开髓(双侧下颌第一磨牙),其中30只分别于术后0、7、14、21、28和35天取下颌骨(用于实验一及实验二),另外25至分别于术后0、14、21、28和35天取下颌骨及下颌下淋巴结(用于实验三)。将实验一的样本通过高分辨率X线活体成像系统及显微CT扫描后制备成组织切片,通过HE染色观察根尖周病变的炎症变化。结果：从开髓后0天至21天,根尖周骨缺损迅速扩大；21天后骨破坏虽继续发展,但速度明显减慢；28天后则趋于平稳。HE染色可见开髓后7天后根尖周组织开始出现少量炎性细胞浸润伴牙槽骨缺损形成,疾病进入急性前期；开髓后21天,炎性细胞浸润明显,骨缺损进一步增大,可观察到脓肿形成；开髓后28至35天,炎性细胞浸润和骨缺损逐渐趋于平稳,无明显扩大的趋势,提示从28天后疾病进入慢性期。结论：该模型的鉴定结果与既往研究结果相符,为可靠有效的根尖周病动物模型,可用于后续研究。实验结果提示开髓后0至21天为炎症急性期,28天之后进入炎症慢性期。本实验首次应用高分辨率X线成像系统观测根尖周骨缺损,发现其可作为一种快速观测及鉴定的方法应用于根尖周病研究。实验二S1P1在根尖周病中的表达及作用目的：观察大鼠根尖周病变过程中不同时期S1P1的表达及变化,并分析其与RANKL的表达以及破骨细胞的数量之间的关系,以探讨S1P1以及S1P1-RANKL信号轴参与根尖周炎病理过程的作用及机制。方法：将实验一中制备的各时期根尖周组织切片通过免疫组织化学染色法检测和分析S1P1和RANKL的表达与变化,通过TRAP染色法检测和分析破骨细胞的表达与变化,并统计分析S1P1与RANKL/TRAP表达的相关性。结果：开髓7天后可以观测到S1P1阳性的细胞表达于根尖周病损,S1P1的表达在炎症急性期(开髓后14天至21天)达到高峰；当炎症进入慢性期(开髓后28天至35天),S1P1的表达逐渐降低并趋于稳定。RANKL及破骨细胞(即TRAP阳性细胞)的表达亦表现出同样趋势。相关性分析提示S1P1与RANKL/破骨细胞的表达均呈正相关。根尖周病损中存在S1P1和RANKL共表达的细胞,该细胞在急性期表达较强,慢性期则较弱。结论：S1P1在根尖周病的病变发展过程中,上调RANKL表达,从而上调破骨细胞的分化及功能,从而导致根尖周骨缺损的形成。S1P1及其相关信号轴(S1P1-RANKL)在根尖周病损的形成和炎症进展的过程中起着重要作用。实验三S1P1在根尖周病中对Th17/Treg的影响及其相关机制的研究目的：检测不同时期大鼠根尖周病变组织中Treg细胞,Th17细胞以及CD4+Foxp3+IL-17+细胞(Treg向Th17分化过程中的“过渡性”细胞,又称Tr17细胞)的表达及变化,以观察根尖周病病理过程中的Treg细胞向Th17细胞转化的现象,并分析其与S1P1的的关系,以探讨S1P1参与根尖周炎病理过程的作用机制。方法：三色及双色免疫荧光染色以检测Tr17在不同时期根尖周病损的表达以及S1P1/IL-17双阳性细胞。收集的开髓后0、14、21、28和35天大鼠下颌骨标本及下颌下淋巴结(实验一),并提取根尖周组织和淋巴结组织的原代细胞。通过流式细胞术检测检测根尖周和淋巴结组织Tr17细胞的表达及变化,检测根尖周组织Treg细胞、Th17细胞表达以及变化；并统计分析S1P1(实验二)与Th17/Treg的相关性。结果：在不同时期(开髓后14天、21天及35天)的根尖周病病损及引流淋巴结中发现了Tr17细胞的存在。开髓14天后,S1P1与Th17细胞的表达呈正相关,与Treg细胞的表达呈负相关。在不同时期根尖周病损中检测到S1P1/IL-17双阳性细胞的表达。结论：S1P1在根尖周病的病变发展过程中,趋化T淋巴细胞在病变组织局部聚集,促进Thl7细胞的分化的同时抑制Treg细胞的分化及功能,从而在一定程度上导致或加剧了Th17/Treg失衡,进而导致破骨细胞数量/功能上调,加剧骨改建的失衡,最终促进了骨破坏的产生；因而在根尖周炎病理过程中具有重要作用。胞转化的现象,并分析其与S1P1的的关系,以探讨S1P1参与根尖周炎病理过程的作用机制。方法：三色及双色免疫荧光染色以检测Tr17在不同时期根尖周病损的表达以及S1P1/IL-17双阳性细胞。收集的开髓后0、14、21、28和35天大鼠下颌骨标本及下颌下淋巴结(实验一),并提取根尖周组织和淋巴结组织的原代细胞。通过流式细胞术检测检测根尖周和淋巴结组织Tr17细胞的表达及变化,检测根尖周组织Treg细胞、Th17细胞表达以及变化；并统计分析S1P1(实验二)与Th17/Treg的相关性。结果：在不同时期(开髓后14天、21天及35天)的根尖周病病损及引流淋巴结中发现了Tr17细胞的存在。开髓14天后,S1P1与Th17细胞的表达呈正相关,与Treg细胞的表达呈负相关。在不同时期根尖周病损中检测到S1P1/IL-17双阳性细胞的表达。结论：S1P1在根尖周病的病变发展过程中,趋化T淋巴细胞在病变组织局部聚集,促进Thl7细胞的分化的同时抑制Treg细胞的分化及功能,从而在一定程度上导致或加剧了Th17/Treg失衡,进而导致破骨细胞数量/功能上调,加剧骨改建的失衡,最终促进了骨破坏的产生；因而在根尖周炎病理过程中具有重要作用。第二部分调控S1P1在根尖周病中的治疗作用目的：研究调控S1P1的药物——芬戈莫德对大鼠根尖周病的治疗效果及药理机制,从而进一步证实S1P1在根尖周病发生发展中的重要作用,同时也为根尖周病的临床治疗提供新思路。方法：将80只成年雌性Wistar大鼠在全麻下开髓,分别于术后7、14、21、28和35天取下颌骨,制备组织切片并提取根尖周组织蛋白。HE染色观察根尖周病变中炎症及骨缺损面积的变化,免疫组织化学检测S1P1、RANKL及OPG的表达与变化,TRAP染色检测破骨细胞的表达与变化,蛋白免疫印记检测根尖周病变组织内Foxp3和IL-17的表达以及变化。结果：芬戈莫德有效下调大鼠根尖周病变组织S1P1的表达,并负调控RANKL、破骨细胞以及IL-17的表达,而Foxp3的表达则得到上调,OPG的表达无显著变化；同时芬戈莫德治疗组根尖周骨缺损面积明显缩小,说明通过芬戈莫德调控S1P1可有效抑制根尖周骨破坏的进展,结论：S1P1调节药物——芬戈莫德在根尖周病的病变发展过程中,通过抑制S1P1,下调RANKL和IL-17的表达,促进Treg细胞表达,改善根尖周炎病理过程中的RANKL/OPG失衡现象,从而下调破骨细胞的分化及功能,抑制骨缺损的形成,因而在根尖周炎的治疗中具有重要作用；本研究亦进一步证实了S1P1在根尖周病发病机制中的重要作用,提示S1P1可以作为根尖周病的治疗新靶点之一。