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壳聚糖是几丁质的脱乙酰基产物,来源丰富,是自然界中仅次于纤维素的第二大天然多糖。具有无毒、易降解、与生物大分子表现出良好的相容性等优点,因而在医药、食品、环境与农业等领域得到了广泛应用。此外,由于其多糖链上含有大量的游离羟基、氨基等可改性接枝基团,壳聚糖在新型色谱填料的开发制备中也有着重要的应用。
在农、兽药残留检测过程中,由于残留物水平较低、属于痕量分析范畴,同时样品基质复杂,在残留检测之前通常需要进行样品净化处理。与传统的样品净化处理技术相比,免疫亲和层析与分子印迹聚合物固相萃取有着选择性高、操作快速简便等优点,表现出良好的应用前景。本研究以禁用蛋白同化类激素—去氢甲睾酮(metandienone,MA)为研究对象,分别制备获得了以壳聚糖为载体的免疫亲和柱及分子印迹亲和柱,并对其性能及应用进行了评价。主要结果如下:
(1)以壳聚糖为载体制备戊二醛交联壳聚糖,并与MA抗体偶联制成免疫亲和吸附剂,制备成免疫亲和柱。用红外光谱、电镜对其进行结构表征,证明壳聚糖已交联且抗体成功偶联。单抗偶联的最适pH为8.0、时间为5h、温度为37℃、环氧氯丙烷终浓度为20%;该亲和柱的最佳洗脱液为4mL的90%甲醇溶液,柱容量约为6500ngMA/g湿亲和吸附剂;柱子的平均回收率为96.9%±1.12%;该柱重复使用次数为8次,回收率高于80%,柱容量保持在85%左右;亲和柱的特异性良好;在空白猪肉样品中加标1.5ng/g、6.0ng/g,回收率分别为83.18%-90.05%、80.84%-89.14%,CV分别为4.06%、4.88%;在空白饲料样品中同样加标1.5ng/g、6.0ng/g,回收率分别为80.84%-90.05%、78.44%-91.09%,CV分别为4.47%、6.46%。
(2)以MA为模板分子,以壳聚糖为功能单体制备了MA分子印迹聚合物,并将其填充到柱子中制成分子印迹亲和柱。壳聚糖与MA的最佳比例为6∶1,最适偶联pH为9.0,蔗糖的浓度为2%,环氧氯丙烷终浓度为1.0%,反应溶液中甲醇∶乙酸水溶液=1∶2;用红外光谱、电镜对其进行结构表征,证明壳聚糖分子印迹聚合物已成功制备。MA印迹亲和柱的最佳上样溶液为10%甲醇溶液,洗涤溶液为蒸馏水,洗脱液为4mL纯甲醇。由动力学试验、Langmuir等温吸附线、Scatchard分析得亲和柱在2h后达到平衡,最大吸附量可达到11.5mg/g湿吸附剂,且MA与聚合物之间存在两类不同的结合位点;柱子的平均回收率为95.94%±2.90%;该柱重复使用次数为18次;MA分子印迹亲和柱对TP、TB的特异性约等于非印迹亲和柱的10倍,特异性良好;在空白猪肉、饲料、猪肝、鸡蛋样品中加标1.5ng/g、6.0ng/g,回收率为94.26%-106.86%,CV小于4.68%。