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原发性肝癌(PLC)是世界上最常见、危害最大的恶性肿瘤之一。肝细胞癌(HCC)是PLC的主要类型,占PLC的90%以上,是第五大常见的恶性肿瘤,其死亡率在全球恶性肿瘤中排第三位。尽管在诊断和治疗方面已经取得很大进展,但HCC预后较差,且容易转移复发,其死亡率仍然较高。研究表明,肝癌细胞、肿瘤相关的巨噬细胞、肝星状细胞、纤维化母细胞、免疫细胞、上皮细胞以及细胞因子等多种成分组成的肝癌微环境是HCC发生发展的主要基础。肝癌微环境在调控肝纤维化、肝癌的形成和复发转移中有着重要作用。其中,肝星状细胞(HSCs)为体内储存脂肪的间质细胞,在肝脏中主要负责胶原的合成表达。肝损伤的时,在转化生子因子(TGF-β1)和血小板源生长因子(PDGF)等因素存在下,激活HSCs转化为肌成纤维细胞(MFB),导致细胞外基质(ECM)重构。当肝损伤继续存在时,HSCs大量增殖,同时分泌细胞因子、趋化因子和生长因子,促进损伤肝细胞向癌细胞转变,进一步发展为肝癌。文献报道,激活的HSCs(aHSCs)有免疫调节作用,其免疫调节功能主要包括抗原呈递功能、表达模式识别受体、分泌免疫抑制细胞因子、表达共刺激分子程序性细胞死亡配体1(PD-L1)等。aHSCs表达PD-L1通过与程序性细胞死亡受体-1(PD-1)结合,调节T细胞应答,抑制免疫,促进肿瘤进一步发展。TGF-β1是肿瘤微环境中大量表达的具有多种功能的细胞因子,在肝癌的发病中扮演重要角色。它能够抑制免疫功能、调节多种细胞的生长和分化、促进肿瘤细胞增殖。TGF-β1是激活HSCs的重要细胞因子,但TGF-β1是否能上调HSCs表面PD-L1的表达,诱导T细胞凋亡,促进肝癌发展及其可能机制目前仍不清楚。本研究旨在观察TGF-β1对HSCs表达PD-L1的影响,是否与ERK1/2通路相关。同时进一步观察TGF-β1刺激的HSCs (TGF-β1-HSCs)是否能诱导T细胞凋亡,减弱T细胞对肝癌细胞HepG2的杀伤。TGF-β1-HSCs细胞与H22细胞移植到小鼠腋下,观察TGF-β1-HSCs对H22肿瘤的形成和发展的影响,以揭示其促进肿瘤生长及可能分子机制。肝癌细胞诱导HSCs活化,同时活化的HSCs又反作用于肝癌细胞,二者相互影响,促进肝癌细胞生长、侵袭及转移。随后观察HepG2与HSCs共培养对HSCs表达PD-L1的变化影响,检测HepG2分泌TGF-β1水平,分析TGF-β1与PD-L1表达的相关性。目的：体外实验观察TGF-β1对人HSCs细胞株LX-2表达PD-L1的影响及TGF-β1刺激的LX-2(TGF-β1-LX-2)对T细胞活力、凋亡的影响,以考察TGF-β1刺激LX-2促进肝癌发展；观察HepG2对LX-2表达PD-L1的影响是否与HepG2分泌的TGF-β1有关,揭示TGF-β1与PD-L1表达的相关性：体内建立TGF-β1-HSCs与小鼠肝癌H22细胞移植瘤模型,探索TGF-β1-HSCs对H22肿瘤生长的影响。方法：体外实验,分别加入5、10、20 ng/ml TGF-β1于LX-2培养液中,培养24、48、72 h后,流式细胞术检测LX-2细胞PD-L1的表达,western blot检测ERK1/2和p-ERK1/2的表达；TGF-β1刺激过LX-2 (TGF-β1-LX-2)与T淋巴细胞共培养48h,收集T细胞,流式细胞术检测T细胞凋亡,CCK-8检测T细胞活力。收集与TGF-β1-LX-2共培养48 h后的T细胞,将T细胞与HepG2继续共培养24 h, MTT检测T细胞对HepG2的杀伤作用。HepG2与LX-2通过transwell小室共培养48 h后,流式细胞术检测LX-2表面PD-L1的表达水平,ELISA法检测肝癌细胞HepG2(48h、72h)上清中TGF-β1水平,分析TGF-β1与LX-2表面PD-L1表达的相关性。体内实验,C57BL/6J小鼠分为5组,H22细胞移植组、未刺激的HSCs+H22细胞移植组、TGF-β1-HSC+H22细胞移植组(TGF-β1:5、10、20ng/ml)。H22细胞移植组注射H22细胞(5×105个)、未刺激的HSCs+H22细胞移植组注射HSC(2×105个)+H22细胞(5×105个),TGF-β1-HSC+H22细胞移植组注射TGF-β1-HSC细胞(2×105个)+H22细胞(5×105个),各组细胞均接种在小鼠左侧腋下,继续饲养21天后,处死小鼠,剥离肿瘤组织,并称重,10%福尔马林固定,HE染色,观察肿瘤组织病理变化,免疫组化检测肿瘤组织中浸润CD3+T细胞数量和a-SMA表达,TUNEL和APC-CD3双染法检测肿瘤组织中T细胞的凋亡,流式细胞仪检测脾脏CD4+T、CD8+T细胞的比例变化。结果：1 TGF-β1上调LX-2细胞表面PD-L1表达可能与ERK1/2通路相关1.1 TGF-β1上调LX-2细胞表面PD-L1表达5、10、20 ng/ml TGF-β1刺激LX-2细胞24 h、48 h、72 h后,流式细胞术检测LX-2表面的PD-L1表达。结果表明,TGF-β1上调LX-2表面PD-L1的表达。1.2 TGF-β1上调LX-2细胞p-ERK1/2表达TGF-β1能激活LX-2细胞内MAPK通路(包括ERK、JNK、P38MAPK通路),有文献报道PD-L1的表达与MEK/ERK1/2信号通路有关,因此我们检测了TGF-β1对LX-2细胞ERK1/2和p-ERK1/2的影响。5、10、20 ng/ml TGF-β1加入LX-2培养液中,48 h后,western blot结果显示,LX-2细胞ERK1/2含量不变,p-ERK1/2的表达增加。1.3 ERK1/2特异性阻断剂U0126下调TGF-β1诱导的LX-2细胞PD-L1表达为了进一步探索TGF-β1上调LX-2细胞表面PD-L1表达是否与ERK1/2通路相关,在LX-2培养液中加入U0126(5 μM)刺激半小时后,再加入TGF-β1 (10 ng/ml),western blot和流式细胞术分别检测LX-2表面PD-L1的表达水平、ERK1/2、 p-ERK1/2的变化。结果显示,TGF-β1上调LX-2表面PD-L1表达。加入U0126后,p-ERK1/2的表达显著下降,PD-L1表达也显著下降。1.4 TGF-β1刺激的LX-2细胞诱导T细胞凋亡PD-L1是抑制性分子,其受体主要表达在T细胞表面,PD-L1与PD-1结合,可促进T细胞凋亡。因此将TGF-β1-LX-2与T共培养,凋亡试剂盒检测T细胞凋亡。结果显示,TGF-β1-LX-2 (TGF-β1:10、20 ng/ml)增加了T细胞凋亡。1.5 TGF-β1刺激的LX-2细胞抑制T细胞增殖TGF-β1-LX-2与T共培养,CCK-8检测T细胞增殖。结果显示,TGF-β1-LX-2抑制T细胞增殖。1.6 TGF-β1刺激的LX-2细胞抑制了T细胞对HepG2的杀伤作用将与TGF-β1-LX-2共培养后的T细胞取出,再与HepG2共培养。实验结果显示,与TGF-β1-LX-2共培养后的T细胞明显减弱对HepG2的杀伤作用。2 TGF-β1-HSCs促进H22肿瘤的生长及对T细胞凋亡和CD3+、CD4+、CD8+T细胞的比例影响2.1 TGF-β1-HSCs促进H22肿瘤结节的生长体内实验结果显示,TGF-β1-HSCs+H22组与与H22组相比,肿瘤体积增大,重量增加,HE病理结果显示,TGF-β1-HSCs+H22组肿瘤弥漫性、不规则生长,侵犯皮肤；H22组肿瘤呈现结节状增长,肿瘤包膜完整,未侵犯皮肤。2.2 TGF-β1-HSCs对H22肿瘤小鼠脾指数和胸腺指数、肝指数的影响结果显示,与H22组相比, TGF-β1-HSCs对H22肿瘤小鼠脾指数、胸腺指数、肝指数无明显影响。2.3 TGF-β1-HSCs促进H22肿癌组织a-SMA表达增多免疫组化显示,H22组肿瘤组织没有a-SMA的表达,HSCs+H22组仅有少量a-SMA的表达。TGF-β1-HSCs+H22组与HSCs+H22组相比,肿瘤组织a-SMA的表达增多。2.4 TGF-β1-HSCs促进H22肿瘤小鼠脾脏和肿瘤组织T淋巴细胞凋亡流式结果显示,与HSCs+H22组相比,TGF-β1-HSCs+H22组,脾脏T细胞凋亡增加；TUNEL与APC-CD3双染,结果显示,TGF-β1-HSCs+H22组肿瘤组织T细胞凋亡增加。2.5 TGF-β1-HSCs降低H22肿瘤小鼠脾脏和肿瘤组织CD4+、CD8+T细胞比例流式结果显示,TGF-β1-HSCs+H22组与HSCs+H22组相比,脾脏CD4+、CD8+T细胞比例下降；与H22组相比,CD4+、CD8+T的比列均下降。肿瘤组织免疫组化显示,TGF-β1-HSCs+H22组和HSCs+H22组相比,肿瘤组织浸润性CD3+T细胞数减少,与H22组相比,肿瘤组织浸润性CD3+T细胞数量减少。3 HepG2对LX-2细胞表面PD-L1的表达变化的影响3.1 HepG2与LX-2细胞共培养,上调LX-2细胞表面PD-L1表达HepG2与LX-2共培养,促进LX-2细胞表面PD-L1的表达增加。3.2 HepG2分泌TGF-β1的水平培养48、72 h的HepG2上清中,HepG2分泌TGF-β1的水平升高。3.3 TGF-β1与PD-L1相关性分析HepG2分泌的TGF-β1与LX-2表面PD-L1的表达呈正相关。结论：1. TGF-β1增加LX-2表面PD-L1表达,可能与ERK1/2信号通路相关。2. TGF-β1-LX-2诱导T细胞凋亡、抑制T细胞活力、减弱T细胞对HepG2的杀伤。3. TGF-β1-HSC促进H22肿瘤小鼠a-SMA的表达增多,减少肿瘤组织CD3+T细胞浸润,促进T细胞凋亡,降低脾脏CD4+T、CD8+T细胞比例,促进肿瘤生长。4. HepG2促进LX-2表面PD-L1的表达,HepG2分泌的TGF-β1与PD-L1的表达呈正相关。