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人细小病毒B19(human parvovirus b19, PVB19)是细小病毒科细小病毒属中目前已知的唯一致人类疾病的病毒,也是动物病毒中体积最小结构最简单的DNA病毒。现已证实该病毒与多种儿童及成人疾病有关。1990年我科首次证实国内存在该病毒感染,随后的研究发现其是我国儿童急性再生障碍性贫血、急性血小板减少性紫癜、胎儿水肿及孕妇非免疫性流产等疾病的重要病因之一,并与先天性心脏病、类风湿关节炎(RA)发病相关。B19病毒是由5.6Kb核苷酸组成,编码一个非结构蛋白(NS1)和两个结构蛋白(VP1, VP2)。B19病毒壳蛋白主要由VP2蛋白组成,VP1蛋白不超过壳蛋白的10%,其独特区暴露在病毒的表面。B19病毒的抗原表位区集中在VP1独特区和VP1-VP2连接区。只有VP1独特区和VP1-VP2连接区基因编码的蛋白才能刺激机体产生保护性抗体。非结构蛋白NS和B19病毒毒力有关。VP1和VP2蛋白,特别是VP1独特区,对B19病毒的诊断和保护性疫苗的制备非常有意义。但是,由于B19病毒不能在传统的培养基上生长繁殖,使B19病毒抗原来源十分困难;加之XA株B19病毒VP1独特区在核苷酸水平和氨基酸水平上与标准株相比存在着显著的差异,故需要大量制备中国株B19病毒VP1蛋白作为抗原,为制备特异性诊断试剂和疫苗创造条件。研究目的:本项实验是在构建B19病毒VP1基因原核表达载体基础上大量表达VP1蛋白,进一步对VP1蛋白进行纯化,以纯化蛋白作为免疫原免疫动物制备其单克隆抗体,检测VP1蛋白的免疫原性及其单克隆抗体的免疫活性,为以后研究VP1蛋白的生物学功能,和B19病毒的防治奠定基础。实验方法:1.首先通过酶切、电泳鉴定我们已构建的VP1-PUC19质粒,将VP1片断连接质粒PQE30,用氯化钙法制备和转化大肠杆菌M15,送菌测序。2.运用IPTG诱导含有VP1-PQE30质粒的发酵培养菌株表达VP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE和Western-blot技术分析蛋白表达情况及鉴定表达蛋白,利用AKTA explorer 100快速纯化系统纯化表达蛋白。3.以纯化的蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,末次加强免疫后3d取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经HAT选择培养,通过ELISA反复筛选阳性克隆,有限稀释法进行5次以上的亚克隆,得到的稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株后用Western-blot鉴定其特异性。实验结果:1.VPl-PUC19经BamHI和SalI双酶切可切出分子量约480bp的片段,与预期结果相符。转化后的大肠杆菌M15测序结果证实序列完全正确。2.含有VP1-PQE30质粒的菌株经诱导剂IPTG诱导,可表达分子量约为22KD的蛋白,经Western-blot鉴定,均可与6-His抗体结合,为VP1融合蛋白。3.经AKTA explorer 100快速纯化系统纯化表达的融合蛋白,收获复性蛋白75g,纯度达95%以上。4.反复筛选获得两株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株:LI和ZH; Western- blot结果显示该单抗有较强的特异性。结论:1.成功构建了人细小病毒B19 XA株VPl基因的原核表达系统VP1-PQE30-M15.2.用发酵罐培养含有VP1-PQE30的大肠杆菌M15,可诱导B19病毒VP1蛋白大量表达。3.通过AKTA explorer 100快速纯化系统进行蛋白纯化,蛋白纯度达95%以上。4.首次在国内建立了可稳定表达的B19病毒VP1蛋白的杂交瘤细胞株,获高效价鼠抗B19病毒VP1蛋白单克隆抗体,为B19病毒VP1基因变异和B19病毒感染检测试剂盒的研究奠定了基础。